专利名称：一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法凝乳酶(chymosin，EC3. 4. 23. 4)是一种从未断奶的小牛胃中发现的天门冬氨酸 蛋白酶，可以使牛奶凝固，被广泛用于干酪制造业，成为食品领域中重要的酶制剂，其产值 占全世界酶制剂的15%。凝乳酶的传统制备方法是从出生10-30天的小牛皱胃中浸提得到凝乳酶。随着世 界干酪产业的不断发展，每年宰杀5000万头犊牛以获得凝乳酶的方法，仍不能满足生产需 要，也与现代工业发展极不协调，因此研究者都在不断寻找新的来源，以促进干酪工业的不 断发展。微生物本身具有生长周期短、代谢物产量大、受气候、地域、时间限制小等优点，利 用微生物生产凝乳酶成本较低、酶提取方便、经济效益高，是目前最有前途的发展方向。微 生物凝乳酶在干酪生产中的应用也已经有很多报道，其性能与传统凝乳酶无明显差异。本发明所用霉菌筛选自我国南方的传统食品江米酒酒醪中，无需考虑微生物非酶 类代谢产生的安全性问题。
实施例1 一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法，所用霉菌筛选自江米酒酒醪，制备步 骤为1)将霉菌在PDA培养基上培养3天后，以含有0. 01 % (m/v)吐温80的无菌水洗 涤3次，收集孢子悬液，制备孢子含量为1. 0 X 106CUF/mL的孢子悬液；2)在10个250mL三角瓶中，分别加入糯米7. 5g，麸皮7. 5g，加入含有葡萄糖2. 8 % (m/v) ,Na2SO4 0. 031% (m/v)、吐温 800. 34% (m/v) ,CaSO4 0. 04% (m/v)、K2SO4 0. 04% (m/ ν)的营养液13. 5mL，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C左右，分别接入1. 5mL霉菌孢子 悬液，30°C培养96h ；3)在发酵物中分别加入IOOmL 0. 3mol/L NaCl溶液，搅拌，40°C，浸提20min后 过滤，收集滤液及滤渣，再向滤渣中加入500mL 0. 3mol/L NaCl溶液，搅拌，40°C，浸提 20min,过滤，收集滤液及滤渣，再向滤渣中加入500mL0. 3mol/L NaCl溶液，搅拌，40°C，浸提 20min,过滤，收集所有滤液，即为凝乳酶浸提液；4)将凝乳酶浸提液选取孔径为60kDa的中空纤维超滤膜，进行超滤，滤液再通过 孔径为6kDa的中空纤维超滤膜，将盐分及小分子物质从发酵液中滤出，得到凝乳酶浓缩液 200mL ；5)在凝乳酶浓缩液中加入6g甘油和IOg海藻糖作为保护剂，60g脱脂奶粉作为载 体，于进口温度74°C，出口温度140°C的喷雾干燥塔中进行喷雾干燥，得到凝乳酶。检测结 果显示该凝乳酶的凝乳活力为248742U/g。实施例2 —种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法，所用霉菌筛选自江米酒酒醪，制备步 骤为1)将霉菌在PDA培养基上培养3天后，以含有0. 01 %吐温80的无菌水洗涤4次， 收集孢子悬液，制备孢子含量为1. OX 106CUF/mL的孢子悬液；2)在20个250mL三角瓶中，分别加入糯米7. 5g，麸皮7. 5g，加入含有葡萄糖2. 8 % (m/v) ,Na2SO4 0. 031% (m/v)、吐温 800. 34% (m/v) ,CaSO4O. 04% (m/v) ,K2SO4O. 04% (m/v) 的营养液13. 5mL，115°C灭菌20min，室温下冷却至30°C左右，分别接入1. 5mL霉菌孢子悬液，30°C培养96h ；3)在发酵物中分别加入85mL 0. 3mol/L NaCl溶液，搅拌，40°C，浸提20min后 过滤，收集滤液及滤渣，再向滤渣中加入1200mL 0. 3mol/L NaCl溶液，搅拌，40°C，浸提 20min，过滤，收集滤液及滤渣，再向滤渣中加入IlOOmLO. 3mol/L NaCl溶液，搅拌，40°C，浸 提20min，过滤，收集所有滤液，即为凝乳酶浸提液； 4)将凝乳酶浸提液选取孔径为60kDa的中空纤维超滤膜，进行超滤，滤液再通过 孔径为6kDa的中空纤维超滤膜，将盐分及小分子物质从发酵液中滤出，得到凝乳酶浓缩液 350mL ；5)在凝乳酶浓缩液中加入7g甘油和14g海藻糖作为保护剂，105g脱脂奶粉作为 载体，于进口温度72°C，出口温度135°C的喷雾干燥塔中进行喷雾干燥，得到凝乳酶。检测 结果显示该凝乳酶的凝乳活力为248789U/g。
一种采用霉菌固态发酵生产凝乳酶的方法，所用霉菌筛选自江米酒酒醪，利用麸皮和糯米作为基础培养基，通过接种霉菌发酵生产凝乳酶，采用NaCl溶液浸提得到凝乳酶粗液，使用中空纤维超滤技术进行浓缩，得到凝乳酶浓缩液，喷雾干燥得固态凝乳酶酶制剂。本发明的有益效果是1)采用传统发酵工艺与现代生物技术相结合的方法生产凝乳酶，所产凝乳酶活力高，发酵产物提取简单，残渣易处理，成本低；2)固态发酵基质中加入了糯米，提高了霉菌产凝乳酶的活力，发酵周期短；3)通过筛选合适的保护剂和载体，实现了喷雾干燥制备凝乳酶，回收率高，所产凝乳酶酶制剂凝乳活力可达248776±50U/g。