专利名称：一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段及其用途的制作方法电压门控钾通道是一类能够允许钾离子透过细胞膜的跨膜蛋白。它们在神经元、 肌细胞以及淋巴细胞等可兴奋及非可兴奋细胞的生物电信号传导中发挥作用。电压门控钾通道家族成员之一的Kvl. 3通道已被证实大量分布于免疫细胞和大脑组织的某些特定区域。因此，近十年来，Kvl. 3通道的研究受到广泛的关注。大量研究证实，Kvl. 3对特定的淋巴细胞亚群发挥着关键性的调节作用。效应型记忆T细胞和/或Ig-class-switched 记忆B细胞在多发性硬化、1型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、移植排斥、移植物抗宿主病、 SjGgren综合征以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的炎症损伤过程中起着至关重要的作用。一系列有关Kvl. 3通道对淋巴细胞亚群调节作用的研究显示，Kvl.3通道能够调节自身反应的效应型淋巴细胞的活化和增殖。伴随着淋巴细胞的激活，Kvl. 3通道高表达于特定的淋巴细胞亚群。Kvl. 3通道在活化的效应型记忆T细胞-Tem和Ig-class-switched 记忆B细胞上的表达量显著升高，约从250个通道/细胞增加至1500个通道/细胞。伴随着淋巴细胞的活化，Kvl. 3通道大量开放，钾离子外流，使得膜电位负值加大，跨膜电势差增大。顺着电势差，钙离子流入细胞内，导致胞内钙离子浓度的增加。而钙离子是重要的第二信使，胞内钙离子浓度的增加能促进Tem和Ig-class-switched记忆B细胞的活化。 抑制Kvl. 3通道能够显著减弱钙离子内流，减少胞内钙离子浓度的增加，从而抑制Tem或 Ig-class-switched记忆B细胞的活化。在体动物实验已证实，抑制Kvl. 3通道能够明显缓解自身免疫性疾病的病理进程。研究表明Kvl. 3成为自身免疫性疾病治疗新的靶点，前景令人瞩目。因此，寻求一种有效的、选择性的Kvl. 3阻断剂将受到更多的关注。目前所筛选出的选择性Kvl. 3通道阻滞剂主要是小分子化合物或从海葵和蝎子毒液中提纯的毒肽类物质。然而研究发现，相当多的一部分小分子化合物及其衍生物和毒肽类物质在阻滞Kvl. 3通道的同时亦能阻滞神经系统和心脏中的电压门控钠、钙等离子通道。由于电压门控钾通道具有较高的结构同源性，使得不同的电压门控钾通道具有高度一致的药物结合位点。研究发现，Kvl. 3通道与心脏复极HERG和KCNQ1/KCNE1钾通道阻滞剂结合位点高度保守，因而使得现有的一些Kvl. 3通道阻滞剂，在阻滞Kvl. 3通道的同时，亦对HERG和KCNQ1/KCNE1通道产生阻滞作用，常常会导致药源性的心律失常的发生，阻碍了一些Kvl. 3通道阻滞剂进一步开发成为临床药物。因此，美国食品和药品管理局要求新上市的药物应评估其对心脏复极电流的影响。抗体与抗原的结合具有亲和力高，特异性强的特点，理论上开发出针对hKvl. 3、具有阻滞效应的抗体可以作为hKvl. 3通道特异性的阻滞剂。本研究以hKvl. 3通道胞外环的一段肽段为免疫原性肽段，通过免疫学的方法制备针对该肽段的特异性抗体，观察其对亲本蛋白hKvl. 3通道以及心脏电压门控钠、钙通道以及复极钾通道的影响。
本发明的目的是提供一种人源性电压门控钾通道hKvl. 3免疫原性肽段，基于该肽段制备的抗体-抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体，可以作为hKvl. 3通道新的、特异性抑制剂。实现本发明的具体技术方案(1) hKvl. 3胞外环肽段E314序列的选择和描述hKvl. 3通道基因位于人1号染色体短臂第1区第3条带的第三个亚带，英文简写为1ρ13. 3，该通道蛋白是一种重要的电压门控钾离子通道，由四个结构相同的α亚基聚合成，每个α亚基由6个跨膜蛋白分子片段Sl S6以及N末端和C末端组成，并具有3个胞外环，分别为Ε1、Ε2和Ε3，构成通道的主体。其中S5，S6主要构成离子通道孔，是钾离子进出细胞的部位。本发明的设计人根据 hKvl. 3通道α亚基跨膜片段S5和S6之间的胞外环肽段氨基酸的亲水性、表露性和柔韧性等，采用Jameson-Wolf算法，通过计算机，选择抗原指数高的包含连续14个氨基酸的一段肽段-hKvl. 3胞外环肽段E314，作为抗原决定簇或半抗原。具体氨基酸序列为=Glu-Ala-A sp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp,并应用该肽段作为抗原决定簇 / 半抗原制备针对该肽段的抗体；该抗体可作为人源性电压门控钾通道1. 3新的、特异性抑制剂，用于对人源性电压门控钾通道1. 3功能的药学应用。(2)hKvl. 3胞外环肽段E314的合成根据E314肽段氨基酸序列采用多肽自动合成仪，固相法合成hKvl. 3通道胞外环肽段E314。(3)抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体的制备采用戊二醛偶联法，以牛血清白蛋白作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。将此抗原与完全或不完全弗氏佐剂一起免疫新西兰大白兔，制备抗hKvl.3胞外环肽段E314抗体。定期测定血清中该抗体的滴度。于免疫 5次后，取血，亲合层析法提纯该抗体。(4)抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对hKvl. 3通道电流的抑制作用通过膜片钳技术，观察抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于人胚胎肾293细胞系上的hKvl. 3 通道电流的抑制作用。该细胞系英文简称为HEK293细胞系。(5)抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体特异性鉴定5-1，通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法，观察抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKvl. 3通道蛋白的结合；5-2，通过免疫印迹法和免疫荧光组织化学法，观察抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达HERG、hKCNQl/hKCNEl通道基因的HEK293细胞系和人心肌细胞上HERG通道、 hKCNQl/hKCNEl通道、电压门控钠通道、L型钙通道蛋白的结合；5-3，通过膜片钳技术，观察抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对上述细胞系和人心房肌细胞通道电流的影响，明确抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体的特异性。发明提供的肽段的有益效果hKvl. 3通道免疫原性肽段E314可作为抗原决定簇/ 半抗原制备针对该肽段的抗体，该肽段也可用作检测、筛选和鉴定对hKvl. 3通道蛋白具有抑制功能的抗体所针对的抗原决定簇。基于hKvl. 3通道胞外环肽段E314制备的抗体-抗 hKvl. 3胞外环肽段E314抗体可作为hKvl. 3通道新的、特异性抑制剂，用于对hKvl. 3通道功能的研究。基于E314肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于自身免疫性疾病或自身免疫相关性疾病的治疗。该抗体可用于文献报道的以hKvl. 3通道为干预靶点的多发性硬化、1型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、移植排斥、移植物抗宿主病、^Ogren综合征以及系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病以及自身免疫相关性疾病，如动脉粥样硬化等的治疗性应用。图IhKvl. 3通道胞外环肽段抗原决定簇预测图。A =Al根据氨基酸的亲水性预测的hKvl. 3通道结构图；A2hKvl. 3通道胞外环肽段氨基酸抗原性预测图.黑线表示所选取的肽段，E314 14个氨基酸；B 根据Jameson-Wolf法筛选出的跨膜片段S5和S6之间胞外环肽段14个氨基酸的抗原指数。图2抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体滴度。图3抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的hKvl. 3通道电流的抑制作用。A对照组稳定表达于HEK293细胞系上的hKvl. 3通道电流；B D 不同浓度抗体组300nmol/L、75nmol/L和37. 5nmol/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对 hKvl. 3通道电流的抑制作用；E 不同浓度抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对hKvl. 3通道电流-电压曲线的影响；F:去极化脉冲为+60mV时各组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果不同浓度抗体组与对照组相比有统计学意义 < 0. 001。图4抗hKvl. 3胞外环肽段Ε314抗体与hKvl. 3通道蛋白的结合。A 免疫荧光结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的hKvl. 3通道蛋白结合。a绿色荧光显示抗体与细胞膜的结合，b无绿色荧光显示细胞核；B:免疫荧光结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与HEK293细胞膜无结合；C 免疫荧光结果显示， 经E314肽段孵育后的抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体，与稳定表达于HEK293细胞膜上的 hKvl. 3通道蛋白无结合；D 免疫印迹结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKvl. 3通道蛋白特异性结合；经E314肽段孵育后的抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKvl. 3通道蛋白无结合；抗hKvl. 3 胞外环肽段E314抗体与HEK293细胞蛋白无结合。图5抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道蛋白的结合。A:免疫荧光结果显示，HEK293细胞无绿色荧光，表明抗hKvl. 3胞外环肽段 E314抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的HERG通道蛋白无结合；B 免疫印迹结果显示， 抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道蛋白无结合。图6抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQl/ hKCNEl通道蛋白的结合。A 免疫荧光结果显示，冊1(293细胞无绿色荧光，表明抗111^1.3 胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞膜上的hKCNQl/hKCNEl通道蛋白无结合； B 免疫印迹结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于HEK293细胞系上的 hKCNQl/hKCNEl通道蛋白无结合。图7抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与人心房肌细胞膜上的离子通道的结合。A 免疫荧光结果显示，人心房肌细胞无绿色荧光，表明抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与表达于人心房肌细胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道、Navl. 5通道、Cavl. 2通道蛋白无结合；Bl 免疫印迹结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于人心房肌的 HERG通道1 α亚基、hKCNQl通道、Navl. 5通道α亚基、Cavl. 2通道α IC亚基蛋白无结合； Β2 免疫印迹结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与稳定表达于人心室肌的HERG通道Ia亚基、hKCNQl通道、Navl. 5通道α亚基、Cavl. 2通道α ie亚基蛋白无结合。图8抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流的抑制作用。A 对照组人心房肌细胞电压门控钠通道电流；B 抗体组300nmOl/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流的影响；C :300nmol/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞电压门控钠通道电流-电压曲线的影响；D 去极化脉冲为-35mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P > 0. 05。图9抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流的抑制作用。A 对照组人心房肌细胞L型钙通道电流；B 抗体组300nmOl/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流的影响；C :300nmol/L抗hKvl. 3胞外环肽段 E314抗体对人心房肌细胞L型钙通道电流-电压曲线的影响；D 去极化脉冲为+IOmV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P > 0. 05。图10抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的HERG 电流的抑制作用。A 对照组稳定表达于HEK293细胞系上的HERG通道电流；B 抗体组 300nmol/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对HERG通道电流的影响；C :300nmol/L抗 hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对HERG通道电流-电压曲线的影响；D 去极化脉冲为+50mV 时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P > 0. 05。图11抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQl/ hKCNEl通道电流的抑制作用。A 对照组稳定表达于HEK293细胞系上的hKCNQl/hKCNEl通道电流；B 抗体组300nmol/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对hKCNQl/hKCNEl通道电流的影响；C :300nmol/L抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对KCNQ1/KCNE1通道电流电流-电压曲线的影响；D 去极化脉冲为+40mV时两组电流密度的平均值，每组记录6个细胞，统计结果抗体组与对照组相比无统计学意义，P > 0. 05。(8)INa 电极内液(mmol/L) :CsF 135, NaCl 5, EGTA 10, HEPES 5,Mg2-ATP 5 用 CsOH 调pH至7. 2。(9) Iceil 细胞外液(mmol/L) =NaCl 135，KCl 5.4，MgCl2 1.0，CaCl2 1.8，NaH2P04 0. 33，HEPES 5. 0，葡萄糖 10. 0，PH 值用 NaOH 调至 7. 4。(10) Iceil 电极内液(mmol/L) =L-Aspartate acid 110，CsCl 20，MgCl2 LNa2-ATP 5,Na2-phosphocreatire 5, Na2GTP 0· 1，cAMPO. 05，EGTA 5, HEPES 5 用 CsOH 调 pH 至 7· 20。(11) Ihekg 细胞外液(mmol/L) :NaCl 137，KCl 4. 0, MgCl2 L 0，CaCl2 L 8，HEPES 10，Glucose 10，用 NaOH 调 pH 至 7. ；35。(12) Ihekg 电极内液(mmol/L) :KC1 20，K-asperate 110，MgCl2 1. 0, Mg2-ATP 5， Na2-Phosphocreatine 5，GTP 0. 1，EGTA 5，HEPES 10，用 KOH 调 pH 至 7. 20。(13) IK_/KeNE1 细胞外液(mmol/L) :NaCl 135，KCl 5. 4，MgCl2 1· 0，CaCl2 1.8, HEPES10. 0，KH2P04 0. 33，Glucose 10，NaOH 调 ρ H 至 7. 40。(14) Ikcnqi/kcnei 电极内液(mmol/L) :KC1 20，K-aspartate 110，MgCl2 1.0， Mg2-ATP5, Na2-phosphocreatine 5，GTP 0. 1，HEPES 10，EGTA 5，用 KOH 调 pH 至 7· 20。(15)凝胶储液(g/L)丙烯酞胺292g，N, N-亚甲叉双丙烯酞胺8g，(避光保存)。(16)浓缩胶缓冲液(g/L) =Tris-HCl 60. 55，SDS 4，HCl 调 pH 至 6. 8。(17)分离胶缓冲液(g/L) =Tris-HCl 181. 65，SDS 4，HCl 调 pH 至 6. 8。(18) 10%过硫酸胺过硫酸胺(Ap) IOOmg加双蒸水溶至1ml，宜新鲜配制。(19)电泳缓冲液(g/L) =Tris 碱 3，甘氨酸 14. 4，SDS 1，HCl 调 pH 至 8. 3。(20)转膜缓冲液(g/L) =Tris碱1. 93，甘氨酸9，甲醇200ml加双蒸水至1L，HCl 调 pH 至 8. 1-8.4。(15)TBST(g/L) =NaCl 8. 775, Tris-Base 1. 211，Tween_203ml，HCl 调 pH 至 7. 5。1. 4 方法1. 4. 1抗原的合成从hkvl. 3通道胞外环筛选出一段短肽E314，其氨基酸序列为 Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-IIe-Pro-Aspο 根据其氨基酸序列采用 PSSM8型多肽自动合成仪，固相法合成多肽。采用戊二醛偶联法，以BSA作为载体蛋白合成多肽-BSA完全抗原。抗原合成完毕后，置于_70°C冰箱中备用。1. 4. 2动物免疫免疫组初次免疫每只兔取抗原800 μ g，后继免疫每只兔取抗原 400μ g，均加等体积弗氏佐剂，初次免疫用完全弗氏佐剂，以后用不完全弗氏佐剂，充分乳化后，于兔子背部、后腿皮下多点注射。每两周加强免疫一次，共5次。假性免疫组用生理盐水加弗氏佐剂假性免疫，剂量与方法同免疫组。1. 4. 3血清标本的留取从初次免疫开始，每次免疫前从兔耳缘静脉抽血1ml，动态观察血清抗体效价，第9周处死，留取血清制备抗体。1.4. 4抗体的制备提纯抗体采用亲合层析法制备提纯，提纯完毕后分装，置于-20°C冰箱中备用(以下称一抗)。1. 4. 5ELISA检测抗体效价以未接受过免疫的健康新西兰大白兔血清为阴性对照， 将不同时段兔血清进行检测。参照本实验室建立的方法将合成的多肽，以每孔ι μ g包被于酶联板，方阵滴定法先后加入制备的一抗及HRP标记的羊抗兔IgG，ΤΜΒ/Η202显色，稀 H2SO4终止反应。在酶标仪450mm波长处测吸收度OD值，以(待测孔OD值-空白孔OD值)/(阴性对照孔OD值-空白孔OD值)彡2. 1为阳性，< 2. 1为阴性。每次试验均设3个复孔阴性对照。取1份阳性样品，进行同一板内及不同板间的重复试验。1. 4. 6稳定表达hKvl. 3通道、HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因HEK293细胞系的
建立(DHEK293细胞培养转染前ld，采用0. 25 %胰酶消化，将处于对数生长期的细胞制备成单细胞悬液，以约3 6X IO5细胞接种于培养板，加含10%胎牛血清的DMEM培养基， 在37°C 5% C02饱和湿度培养箱中，细胞生长至铺满培养板。(2)G418 和潮霉素浓度筛选于 hKvl. 3/pCI-neo，HERG/pcDNA3, hKCNQl/pCEP4 和 hKCNEl/pcDNA3质粒转染前两周，确定G418和潮霉素杀死HEK293细胞的最低浓度。(3)转染分别按照FuGENE HDjttractene转染试剂盒的说明书进行操作。于含 10%胎牛血清的DMEM培养基中缓缓加入脂质体/DNA复合物，摇勻，置于37°C、5% CO2细胞培养箱中培养过夜。(4)克隆筛选转染7 后，更换含10%胎牛血清的DMEM培养基，并开始在DMEM培养基中加入合适浓度的G418和潮霉素。待单克隆长出后，用克隆柱挑选单克隆，扩增后应用全细胞膜片钳技术检测细胞克隆IKvl3、IHEI ；和IKeNQ1/KeNE1的表达，所应用膜片钳记录方法见后。挑选稳定表达Ikv1. 3、IHEEG和 1KcnqiZKCNEI 的细胞克隆。1. 4. 7单个人心房肌细胞的分离按文献采用二步酶解法分离人单个心房肌细胞。 先将心肌组织块剪碎，用36°C 100%氧饱和的无钙台式液反复冲洗三遍，共15min，然后将其置入含150-200U/ml II型胶原酶、1. 2U/ml XXIV型蛋白酶和lmg/ml牛血清白蛋白的无钙台式液中。温孵约50min，再将剩余组织置入上述相同的含胶原酶无钙台式液中继续温孵，每隔IOmin显微镜下观察细胞状况，待镜下细胞数量和质量最佳时，停止温孵，离心获取心房肌细胞。分离好的心房肌细胞置于KB液中，室温下静置Ih备用。1. 4. 8免疫荧光组织化学法观察抗体与稳定表达hKvl. 3通道、HERG和hKCNQl/ hKCNEl通道基因HEK293细胞系和人心房肌细胞的结合HEK293细胞用0. 25%胰酶消化成单细胞后，以合适浓度接种在载玻片上贴壁过夜，而人心房肌细胞滴加在载玻片上，4°C静止30分钟，然后4%多聚甲醛固定30分钟，PBS振洗3次，每次IOmin ； 10%驴血清和牛血清白蛋白湿盒封闭2小时；滴加用封闭液稀释的一抗在4°C冰箱过夜，PBS振洗3次，每次 IOmin ；加FITC标记的1 100驴抗兔IgG室温孵育2小时，PBS振洗3次，每次IOmin ；滴加DAPI，室温孵育5分钟，振洗三次，每次5分钟；抗淬灭封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并照相记录结果。1. 4. 9免疫印迹法观察抗体与稳定表达hKvl. 3通道、HERG和hKCNQl/hKCNEl通道基因HEK293细胞系和人心房肌及心室乳头肌蛋白的结合细胞膜蛋白的提取参考Barry DM 等的方法，提取的蛋白用BCA法测蛋白浓度。每孔取35 μ g蛋白上样于7. 5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，电泳后转移样品蛋白至硝酸纤维素膜上。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBST中室温摇动封闭2. 5小时，加以1 1000 —抗4°C孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次15min， 加入1 10000HRP标记羊抗兔二抗室温孵育2小时，TBST洗膜3次，每次15min，浸入增强化学发光试剂，条带显色后暗室X线压片曝光30秒，洗片，烘干。1. 4. 10全细胞膜片钳记录通过AXOpatCh200B放大器采用全细胞(IKvl.3、INa、Ihei ；) 或穿孔膜片钳技术I Κ_1/Κ Ε1)，记录抗体孵育前后人心房肌细胞和HEK293细胞离子电流。(1) Ikv13程序设置采样频率=IOKHz,低通滤波=5KHz,首先维持电位 (HP) -80mV,给予脉宽M5ms、阶跃IOmV、-60 +60mV的去极化脉冲，然后维持电位 (HP)-50mV，持续50ms，分别记录ΙΚν1.3刺激电流和尾电流，刺激频率=0. IHz0 IKvL3电流强度的计算由基线零电流与测试脉冲末端稳态电流间的差值求出。IKv, 3电流密度=电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的ΙΚν1.3电流密度对相应测试电压绘成电流-电压 (I-V)曲线。0)1贴程序设置采样频率=ΙΟΚΗζ，低通滤波=5KHz,HP = _120mV、脉宽100ms、 阶跃5mV、-70 +30mV的系列去极化脉冲刺激记录INa，刺激频率=IHz0 INa的电流强度的计算测量内向电流峰值与刺激结束后的稳态值之差。I·电流密度=电流强度/膜电容 (pA/pF)。以不同钳制电压下的INa电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。(3) IHERG程序设置采样频率=ΙΟΚΗζ，低通滤波=5KHz，首先给予HP = -80mV, 继而给予脉宽4000ms、阶跃10mV、-40 +50mV的去极化脉冲，然后HP = -50mV,持续 5000ms，分别记录Ihek刺激电流和尾电流(Itail)，刺激频率=0. 05Hz。Itail的电流强度的计算测量阶跃电流的峰值减去刺激结束稳态电流水平(PA)。Itail电流密度=电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的Ihem的Itail电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。(4) ICaL程序设置采样频率=IOKHz，低通滤波=5KHz，HP = _40mV、脉宽300ms、 阶跃10mV、-40 +60mV的系列去极化脉冲刺激记录Ι。Λ，刺激频率=0. 2Hz。ICaL的电流强度的计算测量内向电流峰值与刺激结束后的稳态值之差。ICaL电流密度=电流强度/膜电容(pA/pF)。以不同钳制电压下的电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。(5) Ikcnqi7kcnei程序设置采样频率=IOKHz，低通滤波=5KHz，首先维持电位 (HP) -80mV,给予脉宽3000ms、阶跃20mV、-60 +60mV的去极化脉冲，然后维持电位 (HP) -40mV,持续3000ms，分别记录Ikcnqvkcnei刺激电流和尾电流，刺激频率=0. IHz0 Iks的刺激电流强度的计算测量阶跃电流的峰值减去刺激结束稳态电流水平(PA)。Iks电流密度 =电流强度/膜电容(PA/pF)。以不同钳制电压下的IKNQ1/raE1的刺激电流密度对相应测试电压绘成I-V曲线。实验数据经pCLAMP9. 0软件采集，Digidatal322A模-数/数-模转换器转换，存盘于计算机。实验在室温(20°C 25°C )下进行。1. 5统计学方法数据以均数士标准误表示。采用SPSS12. 0统计软件包，进行t检验和单因素方差分析，P < 0. 05具有统计学意义。结果2. 1抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体滴度变化ELISA检测发现在0周，2周留取的血清抗体滴度为0，第4周留取的血清抗体滴度为1 800，效价偏低，第6周留取的血清抗体滴度为1 6400，效价有一次明显的飞跃。 表明随着免疫时间及免疫次数的增加，抗体的滴度在上升，第8周抗体滴度达1 12800、第 9周抗体滴度也为1 12800，说明抗体滴度已达到相对稳定较高的水平。见图22. 2抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体对ΙΚν1.3的抑制作用。图 3 为预孵 300nmol/L、75nmol/L、37. 5nmol/L 三组浓度抗 hKvl. 3 胞外环肽段E314抗体组与稳定表达hKvl. 3通道基因对照组HEK293细胞系ΙΚν1.3电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，不同浓度Ε314抗体对hKvl. 3电流均有抑制作用，在去极化脉冲为+60mV条件下，300nmol/L E314抗体抑制该电流达94%，Ikvl3电流密度平均值与对照组相比有明显差异(0.0202士0.00437nA/pF vsO. 35224士0. 07443nA/pF, P < 0. 001) ；75nmol/L E314抗体抑制该电流达84%，IKvl 3 电流密度平均值与对照组相比有明显差异(0.05657士0.0196nA/pF vs 0. 35224士0. 07443nA/ pF，P < 0. 001) ；37. 5nmol/L E314抗体抑制该电流达66%，ΙΚν1.3电流密度平均值与对照组相比有明显差异(0. 12054士0. 01692nA/pF vs 0. 35224士0. 07443nA/pF, P < 0. 001)。2. 3抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体与hKvl. 3通道蛋白特异性结合 2. 3. 1免疫荧光组织化学染色结果显示，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体特异性地结合于稳定表达于HEK293细胞膜的hKvl. 3通道蛋白，而抗hKvl. 3通道胞外环肽段E314 抗体与人心房肌细胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道、Navl. 5通道、Cavl. 2通道蛋白及稳定表达于HEK293细胞膜上的HERG通道、hKCNQl/hKCNEl通道蛋白均不结合。见图4 图5图6图72. 3. 2免疫印迹结果表明，抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体能特异识别稳定表达于 HEK293细胞系上的63. 8KD的hKvl. 3通道蛋白。而抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体未识别人心肌和稳定表达于HEK293细胞系上145kDa/155KD的HERG通道蛋白、120KDd的hKCNQl 通道蛋白、190KD的Cavl. 2通道蛋白α 1C亚基和220KD的Navl. 5通道蛋白α亚基。见图 4图5图6图72. 4 抗 hKvl. 3 胞外环肽段 E314 抗体对 INa、ICaL, Iheeg 和 I_1/KCNE1 的影响图8为预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314 300nmol/L抗体组和对照组人心房肌细胞 1-电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为-35mV条件下预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体组INa电流密度平均值无明显差异(0. 03855士0. 00673nA/pF vs 0. 03733士0. 00667nA/pF, P > 0. 05)。图9为预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314300nmol/L抗体组和对照组人心房肌细胞电流图。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对
照组比较，去极化脉冲为+IOmV条件下预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体组电流密度平均值无明显差异(0. 01684士0. 0018nA/pF vs 0. 01603士0. 00323nA/pF, P > 0. 05)。图10为预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314300nmol/L抗体组和对照组HEK293细胞 Iheeg的电流图。Ihei ；在_40mV时迅速激活，峰值电位在OmV，当膜电位大于OmV后，随着膜电位的增加，电流反而减小，呈现出明显的内向整流特性。当恢复到HP = -50mV,记录到电流幅度更高的Itail。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。Itail在 +40mV时达到峰值，当膜电位再升高时尾电流饱和。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为 +40mV条件下预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体组Ihek的Itail电流密度平均值无明显差异(0.03958士0. 00513nA/pF vs 0. 03838士0. 00502nA/pF,P > 0.05)。图11为预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314 300nmol/L抗体组和对照组HEK293细胞 ikcnqi/kcnei的电流图。ikenq1/k e1在_40mV时缓慢激活，失活缓慢，当恢复到HP = -40mV,记录至Ijltail。以各脉冲刺激下平均电流密度值对相应膜电位求得I-V曲线。结果显示，与对照组比较，去极化脉冲为+40mV条件下预孵抗hKvl. 3胞外环肽段E314抗体组Ikcmqviknei电流密度平均值无明显差异(0. 26768士0. 01369nA/pF vs 0. 24104士0. 01804nA/pF, P > 0. 05)。


本发明提供了一种人源性电压门控钾通道1.3免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性电压门控钾通道1.3α亚基跨膜片段S5和S6之间胞外环上连续的13个氨基酸构成，肽段的氨基酸序列为Glu-Ala-Asp-Asp-Pro-Thr-Ser-Gly-Phe-Ser-Ser-Ile-Pro-Asp，通过免疫学的方法制备针对上述肽段的抗体可以作为人源性电压门控钾通道1.3新的、特异性抑制剂，该抗体可用于调节人源性电压门控钾通道1.3功能的研究。基于上述肽段所制备的单克隆抗体和疫苗将有助于自身免疫性疾病或自身免疫相关性疾病的治疗。