专利名称：携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法及其应用的制作方法水稻齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)是上个世纪70年代末发现的一种新病毒，在东南亚、东亚和南亚一些国家局部发生，对水稻生产造成一定影响。目前主要发生流行于我国的广西、福建、湖南、江西、贵州、云南等地。病株表现浓绿矮缩，叶片扭曲呈锯齿状缺刻，在叶背和叶鞘生有细长脉肿。分蘖期前发病不能抽穗，后期发病，抽穗不完全、谷粒不充实等症状。发病田块一般减产10% 20%，严重的减产可达 80% 100%,是影响水稻产量比较严重的病毒病害之一。RRSV为呼肠孤病毒科水稻病毒属(Oryzavirus)的典型成员，引起水稻齿叶矮缩病。RRSV基因组包括10条双链RNA片段 (Sl-SlO)，其形态结构和基因组双链RNA的电泳图谱与该科另外两个属一植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)和斐济病毒属(Fifivirus)的病毒有较大的区别。RRSV具有双层衣壳， 呈二十面体结构，完整病毒粒体的直径约为65nm，核心颗粒约50nm。电镜下可观察到直径 50 66nm或是40nm的病毒粒子分布在感病水稻叶片韧皮细胞的病毒质体(viro-plasm) 中；带毒虫体内的器官或组织里也可观察到直径40 45nm或50 75nm两类球形结晶状粒子，聚集或是分散地排列在细胞质的病毒质体中。水稻锯齿叶矮缩病毒主要由介体昆虫褐飞虱传播，病株液汁、种子和土壤均不传毒。其自然寄主有水稻、蟋蟀草、水蜈蚣和稗草，人工侵染的植物有大麦、小麦、燕麦、玉米、甘鹿、稗等10多种。RRSV的介体昆虫褐飞風 (NiIaparvatalugens)是一种迁飞性昆虫,其传播为持久性方式,但不经卵传播。褐飞風的若虫蜕皮但不失毒，病毒在虫体中的分布以唾液腺中含量最高。介体最小获毒时间是3小时(h)，平均9天(d)。最短的传毒期是lh，接种后10-36d显示症状，传毒率大约为40%。 幼虫可能比成虫的传毒效率更高，雌虫和雄虫，长翅型和短翅型传毒效率相同。介体传毒通常具有间歇性传毒期，可保持1-4周或终生传毒。不同地理种群的褐飞虱具有相似的传毒特性。目前RRSV在我国多个省份流行，已严重影响我国的水稻粮食生产，而抗病品种应用是水稻病毒病最经济、最有效的方法，这就决定迫切需要建立一种RRSV水稻抗性品种的鉴定方法，为抗RRSV的水稻资源的发掘、抗性品种鉴定和品种选育提供技术手段。因为 RRSV传播方式的特殊性，不能用病汁液摩擦接种方式进行接种且不经卵传播，本发明专利采用在病株或冻存病样上饲喂的方式获得携带RRSV的褐飞虱，这为水稻抗性品种的鉴定、 抗病选育、抗RRSV的特异性单克隆抗体的筛选以及褐飞虱与RRSV的互作研究提供物质和技术支持。且本发明提供的通过饲喂方式使褐飞虱从冷冻叶片上获得RRSV的方法，解决了患病植株难以长期保存的问题，拓宽了研究的时间，有利于抗病品种的选育、抗RRSV的特异性单克隆抗体的筛选以及褐飞虱与RRSV的互作等研究工作。
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法及其应用。携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法的步骤如下1)褐飞虱的获得从非水稻齿叶矮缩病毒发生地区的水稻田间捕获褐飞虱后，在室内用非抗虫水稻品种的无毒秧苗饲养，饲养温度为26 30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;待褐飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取种群中10%的褐飞虱用RT-PCR和dot-ELISA 方法分析带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并建立室内种群，以后每代随机抽取种群中10% 的褐飞虱用RT-PCR、dot-ELISA方法确定褐飞虱不带水稻齿叶矮缩病毒，即获得不携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞風;2)褐飞虱的获毒褐飞風从冷冻保存感病水稻病株中获毒用滤纸保湿下I 2龄褐飞虱若虫饥饿2 3小时；-10 _80°C冰箱中取出冷冻保存的感染水稻齿叶矮缩病毒的水稻病株I 3株，放置温室或4°C冰箱中解冻I 3小时后移入以尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器或烧杯中，然后放入已饥饿2 3小时的20-300只 I 2龄褐飞虱若虫，饲毒I 2天后将存活的褐飞虱移至养虫的健康水稻苗，饲毒褐飞虱在健康水稻苗上经过约10 15天病毒循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法检测褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞風;
或者，褐飞虱从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒用滤纸保湿下I 2龄褐飞虱若虫饥饿2 3小时；携带RRSV的水稻病株I 5株用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制植物生长箱中培养，每个装置中放入饥饿3小时后的20 300头I 2龄无毒的褐飞虱若虫，饲毒2 10天后将存活的褐飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养7 12天直至渡过病毒的循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA 方法检测褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞風;
携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，筛选水稻的抗病品种，为抗水稻齿叶矮缩病毒抗病育种服务；
携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为 将携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的I. 5-3叶期水稻苗，采用单苗5头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养2-7天后移出全部褐飞虱，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65 %-75 %，光周期为16L: 8D ;7天以后开始观察病毒症状，连续调查30-40天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻； 根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性；
所述的携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于筛选抗水稻齿叶矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及褐飞虱体内水稻齿叶矮缩病毒的免疫学方法； 携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于研究水稻齿叶矮缩病毒与介体昆虫之间的互作及其传毒机理提供物质基础。本发明与现有技术相比具有的有益效果1)提供的通过饲喂方式使褐飞虱从冷冻叶片上获得水稻齿叶矮缩病毒的方法，解决了患病植株难以长期保存的问题，这样就能在任何时候提供带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于开展抗病品种选育、抗RRSV的特异性单克隆抗体的筛选以及褐飞虱与水稻齿叶矮缩病毒的互作等研究工作。2)通过血清学方法筛选到携带RRSV的褐飞虱可用于筛选抗RRSV的单抗，建立免疫学方法可有效地用于田间作物及褐飞虱中的RRSV的检测，对该病毒病的发生流行进行监测，为科学防控提供依据。


图I RT-PCR方法鉴定RRSV感病水稻的结果；
图2 dot-ELISA方法鉴定RRSV感病水稻的结果；
图3人工条件下冷冻保存后的病样及活的感病水稻植株饲毒褐飞虱的装置图；左-冷冻保存后的病叶，右-活的感病水稻植株；
图4 dot-ELISA方法分析褐飞虱的获毒情况；
图5 RT-PCR方法分析褐飞虱的获毒情况；
图6获毒褐飞虱筛选抗RRSV单抗结果；
图7 RT-PCR方法检测获毒褐飞虱传毒能力的结果。

褐飞虱从冷冻保存感病水稻病株中获毒用滤纸保湿下I 2龄褐飞虱若虫饥饿2 3小时；_10 _80°C冰箱中取出冷冻保存的感染水稻齿叶矮缩病毒的水稻病株I 3株,放置温室或4°C冰箱中解冻I 3小时后移入以尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器或烧杯中， 然后放入已饥饿2 3小时的20-300只I 2龄褐飞虱若虫，饲毒I 2天后将存活的褐飞虱移至养虫的健康水稻苗，饲毒褐飞虱在健康水稻苗上经过约10 15天病毒循回期后， 用RT-PCR、dot-ELISA方法检测褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞風;
褐飞虱从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒用滤纸保湿下I 2龄褐飞虱若虫饥饿2 3小时；携带RRSV的水稻病株I 5株用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制植物生长箱中培养，每个装置中放入饥饿3小时后的20 300头 I 2龄无毒的褐飞虱若虫，饲毒2 10天后将存活的褐飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养 7 12天直至渡过病毒的循回期后，用RT-PCR、dot-ELISA方法检测褐飞虱体内的水稻齿叶矮缩病毒，分析其带毒率，获得携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞風;携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种的抗性，筛选水稻的抗病品种，为抗水稻齿叶矮缩病毒抗病育种服务；
携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于饲喂健康水稻苗来鉴定水稻品种抗性的方法为 将携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱移入待鉴定的种植于温室或植物生长箱的I. 5-3叶期水稻苗，采用单苗5头虫方法接种待鉴定水稻品种，饲养2-7天后移出全部褐飞虱，将稻苗移栽至温室或植物生长箱内，培养温度为26-30°C，相对湿度为65 %-75 %，光周期为16L: 8D ;7天以后开始观察病毒症状，连续调查30-40天；用RT-PCR和dot-ELISA方法检测水稻； 根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻的抗性；
携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于筛选抗水稻齿叶矮缩病毒特异、灵敏的单抗，从而建立以单抗为核心的检测水稻及褐飞虱体内水稻齿叶矮缩病毒的免疫学方法；
携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱用于研究水稻齿叶矮缩病毒与介体昆虫之间的互作及其传毒机理提供物质基础。下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。I、感染RRSV水稻的获得
I)在RRSV发生水稻地区，根据感染RRSV水稻症状，采集感染RRSV水稻植株，如2011 年9月于云南施甸县旧城乡的水稻齿叶矮缩病毒发生区采集具有浓绿矮缩、叶片扭曲呈锯齿状缺刻、在叶背和叶鞘生有细长脉肿的水稻病样。2 ) RT-PCR方法鉴定水稻病样
参照Trizol试剂提取水稻病样的总RNA,根据根据GenBank中报道的水稻齿叶矮缩病毒的衣壳蛋白基因(CP基因)序列(登陆号EU523360)设计特异性引物，RRSV-CP-F 5，CGAATCATCACTGAACAAGTATTTGG 3，和 RRSV-CP-R :5，TCATACACCGGAACCGCTGG 3，。采用 RT-PCR方法检测确定病样感染水稻锯齿叶矮缩病毒。第一链cDNA的合成按照RevertAidTM 逆转录试剂盒说明书进行，即模板RNA 2 W，下游引物I W，RNase Free H2O 9 W。混匀后 70°C下 5 min，取出置冰上 3-5 min ;加入4 W 5 X RT Buffer, 2 dNTP Mix, I W Rnasin Inhibitor,混勻后 37°C下 5 min ;加入 I Ml Reverse Transcriptase,混合后 42°C下反应 lh，70°C下10 min使逆转录酶失活。以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下预变性 94°C 2 min,变性 94°C 45 sec,退火 52°C I min,延伸 72°C 2 min，循环扩增 35 次，最后延伸72°C 10 min。扩增产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳分析，结果如图I所示， 鉴定了采集的样品为感染RRSV的病株。3) Dot-ELISA方法鉴定水稻病样
将水稻病叶称重后用液氮研磨成粉末，按1:10 30 (w/v, g /mL)加入0.01 mol/L PBS (pH7. 4)后研磨；病汁液5000 rpm离心3 min;取3 U I上清点到NC膜上，同时设置健康和感病水稻叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温(10°C -35°C)干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭 30 min ； NC膜放入适度稀释的抗RRSV的单抗中室温孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4 次，每次3 min ； NC膜放入适度稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30 60 min; PBST 洗膜 4 5 次，每次 3 min; 66 u L NBT 和 33 u L BCIP 底物(Promega)加入到 10 ml 底物缓冲液(0. I mol/L Tris C1、0. I mol/L NaCl、0. 025 mol/L MgCl、pH9. 5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂
6洗终止反应，拍照记录结果。结果如图2所示，进一步证明了所采集的样品为感染RRSV的病株。检测后确定带水稻齿叶矮缩病毒(RRSV)的病株培养于温室或物质生长箱内或保存于-10 -80°C冰箱中。2、褐飞虱的获得
从非RRSV发生地区的水稻田间捕获褐飞虱后，在室内用非抗虫水稻品种的无毒稻苗饲养，饲养温度为26-30°C，相对湿度为60 % 75 %，光周期为16L 8D ;待褐飞虱成虫交配后单头虫单独产卵，随机抽取群体中10%的褐飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法分析带毒情况，保留不带毒雌虫的后代并以其建立室内种群，以后每代随机抽取群体中10%的褐飞虱用RT-PCR和dot-ELISA方法确定其确实不带毒，即获得不带RRSV的褐飞虱；
I) dot-ELISA检测揭飞風体是否带毒
单头褐飞風放入I. 5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 u L PBS (0. 01mol/L, PH7. 4)，用牙签捣烂褐飞虱后、5000 rpm离心3 min，取3 U L上清点到NC膜上，膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测水稻中RRSV方法相同，不同的只是二抗为适度稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG 二抗，显色底物是HRP的显色底物，即TMB显色底物。同时设非带毒和带毒的褐飞虱作为阴性和阳性对照。检测结果表明褐飞虱没有携带RRSV。2) RT-PCR方法检测褐飞虱是否带毒
参照Trizol试剂说明书提取单头褐飞虱的总RNA，根据上述水稻齿叶矮缩病毒的衣壳蛋白基因(CP基因)序列设计的特异性引物，采用上述检测水稻样品一样的RT-PCR方法检测褐飞虱是否带毒，检测结果进一步证明褐飞虱为非带毒的虫子。3、褐飞虱从感染RRSV的水稻植株中获毒 I)褐飞風从冷冻保存感病水稻病株中获毒
用滤纸保湿下20-300只f 2龄褐飞虱若虫饥饿2-3小时。-10 _80°C冰箱中取出冷冻保存的感染RRSV的水稻病样1-3株，放置温室(IO0C -350C )或4°C冰箱中解冻，1-3小时后移入以尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器或烧杯中，然后放入饥饿2-3小时的20-300只 r2龄褐飞虱若虫，这样就有较好的空气流动性确保褐飞虱存活，同时又可防止褐飞虱逃出容器。饲毒1-2天后将存活的褐飞虱移至养虫的健康水稻苗，并记录存活的褐飞虱数量。饲毒褐飞虱在健康水稻苗上经过病毒循回期，约10-15天后，记录存活的褐飞虱数量。对一部分褐飞虱进行上述RT-PCR和dot-ELISA方法进行带毒率分析。结果如图4、5所示，表明饲喂冻存保存的病株的褐飞虱的存活率为80%，带毒率为30%。2)褐飞虱从种植于温室或植物生长箱内的水稻病株上获毒
用滤纸保湿下20-300只f 2龄褐飞虱若虫饥饿2-3小时。经上述检测鉴定携带RRSV 的水稻病株，用尼龙纱布封口的圆形开口塑料容器封闭在温湿度控制植物生长箱中培养， 良好的空气流动确保植株与褐飞虱的存活，又避免褐飞虱的逃逸。每个塑料容器放1-5株病株植物。每个装置中放入饥饿3小时后的20-300头1-2龄无毒的褐飞虱若虫。培养温度为26-30°C，相对湿度为60 %-75 %，光周期为16L :8D。饲毒2_10天后将存活的褐飞虱移入新鲜健康水稻苗上饲养直至渡过病毒的循回期，约7-12天，并记录存活的褐飞虱数量。并通过上述RT-PCR、dot-ELISA等方法检测验证。接种后对移出的130褐飞虱进行上述RT-PCR 和dot-ELISA检测，其带毒率为50%。这表明褐飞虱从培养的水稻病株上获得RRSV的几率较闻。
4、获毒褐飞虱的应用
I)获毒褐飞虱用于筛选抗RRSV的单抗
单头带毒褐飞風放入I. 5 mL的eppendorf的离心管中，并加入100 u L PBS (0. Olmol/ L，pH7. 4)，用牙签捣烂褐飞虱后、5000 rpm离心3 min，取3 上清点到NC上，室温 (IO0C -350C )干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST (含0. 05% Tween-20的
0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min ； NC膜放入不同的杂交瘤细胞培养上清液中室温孵育30-60 min ;用PBST洗膜3 4次，每次3 min ； NC膜放入适度稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 二抗中室温孵育30 60 min; PBST洗膜4 5次，每次3 min;用 TMB底物显色。若出现蓝色斑点，则为阳性，表明此细胞株能产生抗RRSV的抗体。检测结果如图5所示。2)获毒褐飞虱的传毒及水稻抗性鉴定
将上述从冷冻保存的病株或活的感病水稻植株上获毒的褐飞虱移入待鉴定的水稻苗 (I. 5-3叶期)在温室或植物生长箱饲养2-7天，培养温度为26-30°C，相对湿度为60 %_75 %，光周期为16L :8D。采用单苗5头虫方法接种I. 5-3叶期的待鉴定水稻品种，每个品种选取100水稻苗鉴定，2-7天后移出全部褐飞虱，再将稻苗移栽至温室或植物生长箱内生长。7 天以后开始调查，每天调查一次，连续调查40天。调查标准参照水稻齿叶矮缩病的典型症状浓绿矮缩、叶片扭曲呈锯齿状缺刻、在叶背和叶鞘生有细长脉肿。进一步用上述RT-PCR 和dot-ELISA方法检测接种后的水稻，观察到有典型症状的水稻均能扩增到目的条带，无发病症状的水稻均不能扩增到目的条带，结果如图6所示。这表明褐飞虱从冷冻保存或和活的感病植株上获得RRSV后能接种到健康水稻上。同理，可根据饲喂接毒水稻的病毒症状及其RT-PCR和dot-ELISA检测结果判断水稻品种的抗性，即建立了 RRSV水稻抗性品种的鉴定方法，为抗RRSV的水稻资源的发掘、抗性品种鉴定和品种选育提供技术手段。


本发明公开了携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱的获得方法及其应用。利用感染RRSV的水稻活体植株或者冷冻保存的水稻病样饲喂褐飞虱，使其获得水稻齿叶矮缩病毒，再将褐飞虱移至不带毒的健康水稻叶片上饲喂，直至渡过病毒的循回期而获毒。本发明获得的带毒褐飞虱可用于筛选抗RRSV的高灵敏度、高特异性的单抗，从而为该病毒病的预警预报，科学防控该病毒病提供物质和技术手段。同时，本发明专利获得的携带RRSV的褐飞虱可进行水稻接种实验鉴定水稻品种的抗性，筛选抗病品种，并为抗病育种服务。另外，本发明获得的携带RRSV褐飞虱为RRSV与褐飞虱介体间的互作及其传毒机理等的研究提供物质基础。