专利名称：发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环sftsv介导等温扩增快速检测试剂盒及方法发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopeniasyndrome bunyavirus, SFTSV),目前已被确认为是2004年以来湖北、河南、江苏、浙江等地区高度散发出现的发热伴血小板减少综合征的主要病原体。经国家疾控中心相关研究，该病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒。 与其他布尼亚病毒科白蛉病毒属病毒相似，SFTSV的基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA片段组成。各片段末端互补。其中大(L)片段全长6368个核苷酸，编码 RNA 依赖型 RNA 聚合酶(RNA dependent RNA polymerase, RdRP);中(M)片段全长3378个核苷酸，编码一个具有1073个氨基酸的膜蛋白前体，该蛋白前体经宿主细胞蛋白酶修饰，可进一步形成Gn膜蛋白和Ge膜蛋白；小(S)片段全长1744个核苷酸，具有双向读码框，分别编码核蛋白(Nucleocapsid protein,N)和非结构蛋白NSs。目前白蛉属病毒分两个组，一组为人类致病病毒组，如立夫特谷热病毒(Rift Vally Fever Virus)等，另一组为对人类不致病的病毒组，如乌库病毒(Uukuniemi virus)。而SFTSV经分析应属新的第三组病毒。自2004年以来，我国多省份陆续发生了发热伴出血，白细胞减少及血小板减少，多脏器受损的病例。病人多来自华中山区，农业区，流行时间为每年4到8月份，与节肢动物活动繁殖期相吻合。病例都有明确的蜱虫叮咬历史，其发病死亡率达到12%-30%。在2009年，在河南一份发热伴血小板减少综合征病例标本中分离到一株新型布尼亚病毒。后又在2010年分离到20株同种病毒。经相关基因组生物信息学分析和电子显微镜形态学研究，该新型病毒属于布尼亚病毒科白蛉病毒属的一种新病毒，命名为发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒，即SFTSV。此外，这类发热伴血小板减少综合症还有另外一种主要病原体，即嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)。嗜吞曬细胞无形体感染产生的症状与SFTSV十分相似，没有典型特征性症状和区别，该无形体感染的发病死亡率达到22%。目前，这类发热伴出血，白细胞减少及血小板减少的病例，主要就是由嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)和新型布尼亚病毒SFTSV感染引起。虽然这两种感染在症状表现上没有明显区别，死亡率也都很高，但其对症治疗方法则差别很大。对于嗜吞噬细胞无形体感染，主要应用强力霉素和四环素。而对抗生素和抗病毒药物不敏感。过多使用其他抗生素和抗病毒药物还会造成器官负担加重，脏器受损，病死率上升。对于新型布尼亚病毒SFTSV感染，则应尽早使用利巴韦林等抗病毒药物及抑制后续细菌真菌感染的各类敏感型抗生素配合治疗。由此可见，对于因这两类病原体感染引起的出血伴血小板减小综合症病例，必须尽可能的以最快速度获得精确的定性诊断结果，这样才能及时为患者制定正确的治疗方案，否则，误诊，延误，就会导致病情的延误和错误的治疗方案，甚至错过治疗时机，造成病人死亡。所以，目前急需能快速、精确的诊断这些主要病原体，尤其是对新型SFTSV病毒进行快速精确诊断的诊断方法，并且要求这种诊断方法操作简便，成本低廉，适于农村，山区等欠发达地区有限的医疗资源和人员、设备条件，还要具有良好的灵敏度和高度的特异性。 根据卫生部2010年发布的《发热伴血小板减少综合征诊疗方案》，我国检测新型布尼亚病毒SFTSV的检测方法主要有(1)血清中特异性抗体的检测；(2)病原体核酸的PCR检测；(3)病毒分离培养等方法。传统的血清学检测方法和病毒分离培养法。这些检测法本身大都需要数周时间才能获得准确的结果，完全无法及时对发病病患做出及时的诊断，且大都要求据有相当水准的实验技能和一些精密的诊断仪器。因此无法满足在农村，山区等条件艰苦地区开展。此外，由于患者血清中病毒血症的发生要大大早于病毒的特异性抗体的出现，因此相比于传统的血清学检测方案，基于核酸检测的PCR技术可以在更早的阶段对病原体做出精确的诊断。但是，PCR检测技术需要需要昂贵的设备和试剂，荧光定量PCR更是需要昂贵的探针和复杂的操作步骤，对人员的操作水平也有较高的要求，不适于在乡村，山区，县一级卫生院等一线采用。
针对上述现有技术，本发明提供了一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，及其使用方法，以及在检测布尼亚病毒中的应用。本发明的布尼亚病毒SFTSV环介导等温扩增快速检测方法，以低廉的检测成本、方便的操作、快速的检测速度，实现了高度特异性及与PCR相同的高灵敏度，将成为现有检测技术的有力补充，为发热伴血小板减少综合症的及时诊疗提供科学的依据，成为一种有效的诊断检测手段。本发明是通过以下技术方案实现的发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，该试剂盒包括以下组分(1)1(^扩增检测反应液扩增检测反应液由水、200臟01/1 Tris-HCKpH 8.8)、100mmol/L KCl、80mmol/L MgS04、100mmol/L (NH4) 2S04 和 8mol/L Betaine 组成;(2)25mmol/l dNTP (四种等量的脱氧核糖核酸的混合物)；(3)扩增检测用引物组为S片段特异性引物组、L片段特异性引物组或M片段特异性引物组，其中，S片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I 6所示,如表I所示；L片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7 12所示,如表2所示；M片段特异性引物组由F3/B3外引物、FIP/BIP内引物和LF/LB环引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 13 18所示，如表3所示；表I.针对SFTSV病毒S片段的检测引物

本发明公开了一种发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒环SFTSV介导等温扩增快速检测试剂盒，由以下组分组成(1)10X扩增反应液2.5μl；(2)25mmol/l dNTP2μl；(3)F3/B3外引物各5pmol；FIP/BIP内引物各40pmol；LF/LB环引物各20pmol；(4)Bst DNA聚合酶1μl；(5)反转录酶1μl；(6)荧光染料1μl；(7)ddH2O。使用时，加入待检测者的RNA，扩增后，观察反应体系的颜色变化，并以此判断检测结果。本发明检测试剂盒及检测方法，检测成本低廉、操作方便、检测速度快，实现了高度特异性及与PCR相同的高灵敏度，为发热伴血小板减少综合症的及时诊疗提供科学的依据。