专利名称：包含胰岛素、烟酰胺和氨基酸的制剂的制作方法糖尿病是其中利用葡萄糖的能力部分或完全丧失的代谢病症(disorder)。所有人中约5%患糖尿病且该病症接近流行比例。自从20世纪20年代引入胰岛素以来，在糖尿病治疗中已作出连续改善。为了帮助避免高血糖水平，糖尿病患者经常实施多次注射疗法，每次进餐都给予胰岛素。因为糖尿病患者已用胰岛素治疗了几十年，主要需要安全和改善生活质量的胰岛素制剂。在市售获得的胰岛素制剂中，可提及速效、中效和长效制剂。在糖尿病的治疗中，已提出和使用许多种胰岛素药用制剂，比如普通胰岛素(比如Actrapid )、低精蛋白胰岛素(标识为NPH)、胰岛素锌混悬液(比如Semilente 、 Lente 和Ultralente )，和双相低精蛋白胰岛素(比如NovoMix )。也已开发人胰岛素类似物和衍生物，针对特定作用情况(profile)即速效或长效设计。包含此类速效胰岛素类似物的一些市售获得的胰岛素制剂包括NovoRapid (B28Asp人胰岛素制剂)、Humal0g (B28LysB29Pro人胰岛素制剂)和Apidra(B3LysB29Glu人胰岛素制剂)。国际申请WO 91/09617和W0/9610417 (Novo Nordisk A/S)公开含有烟酰胺或烟酸或其盐的胰岛素制剂。大多数情况下，胰岛素药用制剂是通过皮下注射给药。对于患者重要的是胰岛素的作用情况，指胰岛素对葡萄糖代谢的作用作为从注射开始的时间的函数。在该情况中，起始时间、最大值和总作用持续时间尤其重要。在一剂量胰岛素的情况下，患者期望和要求具有不同作用情况的多种胰岛素制剂。在同一天，一个患者可能使用具有非常不同的作用情况的胰岛素制剂。期望的作用情况例如取决于当天的时间和患者进餐的量和组成。对于患者同等重要的是胰岛素制剂的化学稳定性，例如由于多次(abundant)使用笔样注射装置比如含有Penfill 药筒的装置，所述药筒中贮存胰岛素制剂直至整个药筒变空，对于含有1. 5-3. Oml药筒的装置可能是至少1-2周。在贮存过程中，在胰岛素结构中发生共价化学变化。这可导致形成可能活性较小和/或潜在地产生免疫性的分子比如脱酰胺产物和较高分子量的转化产物(二聚体、聚合物)。而且，胰岛素制剂的物理稳定性也重要，因为长期贮存可最终导致形成不溶性原纤维，它们在生物学上无活性和潜在地产生免疫性。发明概述本发明涉及具有有利的吸收速率和有利的化学和物理稳定性的胰岛素制剂。本发明涉及包含人胰岛素和/或其类似物、烟酰胺或烟酸和/或其盐和精氨酸的胰岛素制剂。在一个实施方案中，本发明涉及胰岛素制剂，其包含 胰岛素化合物， 烟碱化合物，和 精氨酸。在另一个实施方案中，胰岛素制剂可进一步包含谷氨酸。在另一个实施方案中，本发明还考虑治疗受试者糖尿病或降低受试者血糖水平的方法，其包含给予受试者或哺乳动物本发明的胰岛素制剂。图1显示本发明制剂在37°C贮存2周过程中降解产物的总胰岛素含量百分数的发展。字母A指NovoRapid 参考物，其余字母对应于实施例1表1所述天冬胰岛素(insulin aspart)制剂。与NovoRapid 制剂(制剂A)相比，添加烟酰胺(制剂B和D)导致降解产物的形成增加，而组合添加烟酰胺、谷氨酸和精氨酸(制剂C和E)，具有大部分类似的降解模式，HMWP的形成较低。图2显示本发明制剂在37°C贮存2周过程中降解产物的总胰岛素含量百分数的发展。字母A指NovoRapid 参考物，其余字母对应于实施例1表1所述天冬胰岛素制剂。 组合添加烟酰胺、谷氨酸和精氨酸(制剂F、G、H和I，区别在于缓冲体系，磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷缓冲液，和胰岛素和Si的浓度，0. 6mM和0. 3mM或1. 2mM和0. 6mM)具有类似于 NovoRapid 制剂(制剂A)的降解模式。图3显示在猪中以lnmol/kg剂量皮下注射本发明制剂后0分钟的血浆葡萄糖浓度(平均数+/-SEM，N = 8)。字母A指NovoRapid 参考物，其余字母对应于实施例1表1 所述天冬胰岛素制剂。与NovoRapid 制剂(制剂A)相比，添加烟酰胺的制剂(制剂N)的血浆葡萄糖降低的初始速率更快，甚至添加烟酰胺和精氨酸的组合(制剂M)更快。图4显示在猪中以lnmol/kg剂量皮下注射本发明制剂后0分钟的血浆葡萄糖浓度(平均数+/-SEM，N = 7)。字母A指NovoRapid 参考物，其余字母对应于实施例1表1 所述天冬胰岛素制剂。与NovoRapid 制剂(制剂A)相比，具有烟酰胺、精氨酸和谷氨酸组合的制剂(制剂L)的血浆葡萄糖降低的初始速率更快，且具有烟酰胺和精氨酸组合的制剂 (制剂K)更快。图5显示在猪中以lnmol/kg剂量皮下注射本发明制剂后0分钟的血浆天冬胰岛素浓度(平均数+/-SEM，N = 7)。字母A指NovoRapid 参考物，其余字母对应于实施例1 表1所述天冬胰岛素制剂。与NovoRapid 制剂(制剂A)相比，具有烟酰胺的制剂(制剂 J)、具有烟酰胺和精氨酸组合的制剂(制剂K)和具有烟酰胺、精氨酸和谷氨酸组合的制剂 (制剂L)的胰岛素组分初始吸收速率明显更快。发明描述意外发现本发明胰岛素制剂中的胰岛素化合物在皮下注射后的吸收快于参考胰岛素制剂。这种性质可用于速效胰岛素，特别是连同每餐前给予胰岛素的多次注射方案。因为作用起效更快，所以可以比常规速效胰岛素溶液更接近进餐方便地使用该胰岛素。而且， 胰岛素的更快消失可能减小餐后低血糖的危险。本发明的胰岛素制剂是速效胰岛素制剂，其包含胰岛素化合物比如天冬胰岛素、 烟碱化合物比如烟酰胺和氨基酸精氨酸。任选地，本发明的胰岛素制剂可包含其它氨基酸比如谷氨酸。这些胰岛素制剂具有比现有疗法更接近地模拟正常生理学的快速吸收情况。 而且，本发明的胰岛素制剂具有适合市售药用制剂的化学和物理稳定性。本发明的胰岛素制剂提供比现有胰岛素疗法甚至更快的起始作用。此类超快速胰岛素制剂具有恢复第一阶段(first phase)胰岛素释放、注射方便性和停止肝葡萄糖生成的优点。本发明的胰岛素制剂具有有利的从皮下组织进入血浆内的吸收速率，与常规制剂比如NovoRapid 相比，初始吸收速率增至1. 5至5倍范围，如通过在猪的几种H(/PD实验所提示。这种更快的吸收速率可改善血糖控制和方便性，可允许从餐前改为餐后给药。本发明部分基于以下意外发现，即虽然添加烟酰胺让吸收速率增加，但它还通过明显增加HMWP 的量对化学稳定性产生负面影响。本发明的胰岛素制剂通过添加精氨酸具有改善的化学稳定性，这反映在例如贮存后二聚体和聚合物和脱酰氨基胰岛素的形成减少。而且本发明的胰岛素制剂还可具有改善的物理稳定性，这可有助于在泵中使用。本发明提供胰岛素制剂，其包含存在浓度为约0. ImM-约10. OmM的本发明胰岛素化合物，其中所述制剂具有3-8. 5的pH。制剂还包含烟碱化合物和精氨酸。制剂可进一步包含蛋白酶抑制剂、金属离子、缓冲体系、防腐剂、张度剂(tonicity agent)、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施方案中胰岛素制剂包含人胰岛素、类似物或其组合、烟酰胺和/或烟酸和/或其盐和精氨酸和/或其盐。在一个实施方案中，本发明的胰岛素制剂包含B28Asp人胰岛素、烟酰胺和精氨酸的水溶液。在注射制剂中，B28Asp人胰岛素在本发明溶液中的含量可为15-500国际单位 (IU)/ml范围，优选50-333IU/ml范围。但是，对于胃肠外给药的其它目的，胰岛素化合物的含量可以更高。本文还描述包含胰岛素化合物、烟碱化合物和谷氨酸的胰岛素制剂。在本发明上下文中单位〃 IU"对应于6nmol。术语“天冬胰岛素”指人胰岛素类似物B28Asp人胰岛素。术语“起始”指从注射直到1 曲线位移至增加的时间。术语“吸收速率”指1 曲线的斜率。本发明的“胰岛素化合物”在本文理解为人胰岛素、胰岛素类似物和/或其任何组I=I O术语“人胰岛素”用于本文指公知其结构和性质的人激素。人胰岛素具有两条多肽链，通过半胱氨酸残基之间的二硫桥连接，即A-链和B-链。A-链是21氨基酸肽，B-链是30氨基酸肽，两条链通过三个二硫桥连接一个在A-链的6与11位半胱氨酸之间，第二个在A-链的7位半胱氨酸与B-链的7位半胱氨酸之间，第三个在A-链的20位半胱氨酸与B-链的19位半胱氨酸之间。将激素合成为由以下组成的单链前体前胰岛素(前胰岛素原) 个氨基酸的前肽，接着是含有86个氨基酸的前胰岛素，其构型为前肽-B-Arg Arg-C-Lys Arg-A，其中C 是31个氨基酸的连接肽。Arg-Arg和Lys-Arg是用于连接肽从A和B链分裂的分裂位点。“胰岛素类似物”用于本文指从天然存在胰岛素例如人胰岛素的原始结构通过突变而衍生的多肽。通过缺失和/或取代天然存在胰岛素中存在的至少一个氨基酸残基和/ 或通过加入至少一个氨基酸残基制造一种或多种突变。加入和/或取代的氨基酸残基可以是可编码的氨基酸残基或其它天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中胰岛素类似物与母胰岛素相比包含少于8个修饰(取代、缺失、添加及其任何组合)，或者与母胰岛素相比小于7个修饰，或者与母胰岛素相比小于6个修饰，或者与母胰岛素相比小于5个修饰，或者与母胰岛素相比小于4个修饰，或者与母胰岛素相比小于3个修饰，或者与母胰岛素相比小于2个修饰。胰岛素分子中的突变通过指出链(A或B)、位置和取代天然氨基酸的氨基酸的三字母编码而表示。“如纽30”或1(1-29) ”指缺乏B30氨基酸残基的天然胰岛素B链或其类似物，B28Asp人胰岛素指其中B链观位的氨基酸残基已被Asp取代的人胰岛素。胰岛素类似物的实例是以下这些其中B链28位的Pro被Asp、Lys, Leu、Val或 Ala突变，和/或B^位的Lys被ftx)、Glu或Asp突变。而且，B3位的Asn可被Thr、Lys, Gin、Glu或Asp突变。A21位氨基酸残基可被Gly突变。Bl位氨基酸可被Glu突变。B16 位氨基酸可被Glu或His突变。胰岛素类似物的其它实例是缺失类似物，如其中人胰岛素 B30氨基酸已缺失的类似物(des(B30)人胰岛素)、其中人胰岛素Bl氨基酸已缺失的胰岛素类似物(des(Bl)人胰岛素)、des(B^-B30)人胰岛素和des (B27)人胰岛素。其中A-链和/或B-链具有N-端延伸的胰岛素类似物和其中A-链和/或B-链具有C-端延伸比如有2个精氨酸残基加入B-链C-端的胰岛素类似物也是胰岛素类似物的实例。其它实例是包含上述突变的组合的胰岛素类似物。其中A14位氨基酸是Asn、Gin、Glu、Arg、Asp、Gly 或His，B25位氨基酸是His和任选进一步包含一个或多个另外突变的胰岛素类似物是胰岛素类似物的其它实例。其中A21位氨基酸残基是Gly和其中胰岛素类似物在C-端被两个精氨酸残基进一步延伸的人胰岛素的胰岛素类似物也是胰岛素类似物的实例。胰岛素类似物的其它实例包括，但不限于DesB30人胰岛素；AspB^人胰岛素； AspB28, desB30 人胰岛素；LysB3，GluB29 人胰岛素；LysB28，ProB29 人胰岛素；GlyA21， ArgB31, ArgB32 人胰岛素；GluA14，HisB25 人胰岛素；HisA14，HisB25 人胰岛素；GluA14， HisB25, desB30 人胰岛素；HisA14, HisB25, desB30 人胰岛素；GluA14, HisB25, desB27, desB28, desB29, desB30 人胰岛素；GluA14，HisB25, GluB27, desB30 人胰岛素；GluA14， HisB16, HisB25, desB30 人胰岛素；HisA14, HisB16, HisB25, desB30 人胰岛素；HisA8, GluA14, HisB25, GluB27, desB30 人胰岛素；HisA8，GluA14, GluBl, GluB16, HisB25, GluB27, desB30 人胰岛素；和 HisA8, GluA14, GluB16, HisB25, desB30 人胰岛素。术语“烟碱化合物”包括烟酰胺、烟酸、尼克酸(niacin)、尼克酰胺和维生素B3和 /或其盐和/或其任何组合。根据本发明，烟碱化合物和/或其盐的浓度为约ImM-约300mM或者为约5mM_约 200mM范围。术语“精氨酸”或“Arg”包括氨基酸精氨酸和/或其盐。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含I-IOOmM精氨酸。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含l_20mM精氨酸。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含20_90mM精氨酸。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含30_85mM精氨酸。术语“谷氨酸”或“Glu”包括氨基酸谷氨酸和/或其盐。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含I-IOOmM谷氨酸。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含20_90mM谷氨酸。在一个实施方案中，胰岛素制剂包含30_85mM谷氨酸。术语“药用制剂”或“胰岛素制剂”用于本文指一产品，它包含胰岛素化合物(即人胰岛素、其类似物和/或其组合)和烟碱化合物和氨基酸，任选连同其它赋形剂，比如防腐剂、螯合剂、张度调节剂、填充剂、稳定剂、抗氧化剂、聚合物和表面活性剂、金属离子、油性溶媒和蛋白质(如人血清白蛋白、明胶或蛋白质)，通过将所述胰岛素制剂给予人，所述胰岛素制剂可用于治疗、预防或降低疾病或病症的严重度。因此，胰岛素制剂在本领域也称为药用制剂或药用组合物。缓冲剂可选自，但不限于，乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)_氨基甲烷、N，N-二羟乙基甘氨酸(biCine)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂中每一种都构成本发明的备选实施方案。本发明的胰岛素制剂可进一步包含对于胰岛素制剂常见的其它成分，例如锌络合剂比如柠檬酸盐，和磷酸盐缓冲剂。甘油和/或甘露醇和/或氯化钠可以对应于0-250mM、0-200mM或O-IOOmM浓度的
量存在。稳定剂、表面活性剂和防腐剂也可存在于本发明的胰岛素制剂中。本发明的胰岛素制剂可进一步包含药学上可接受的防腐剂。防腐剂可以足够获得防腐效果的量存在。防腐剂在胰岛素制剂中的量可以从例如本领域文献和/或例如在市售产品中防腐剂的已知量确定。这些具体防腐剂中每一种都构成本发明的备选实施方案。防腐剂在药用制剂中的用途描述于例如Remington :The Science and Practice of Pharmacy, % 19 片反，1995。存在于本发明胰岛素制剂中的防腐剂可以像在迄今为止的常规胰岛素制剂中那样，例如苯酚、间甲酚和对羟基苯甲酸甲酯。本发明的胰岛素制剂可进一步包含螯合剂。螯合剂在药用制剂中的用途为技术人员公知。为了方便，参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版， 1995。本发明的胰岛素制剂可进一步包含稳定剂。术语“稳定剂”用于本文指加入含多肽的药用制剂中使肽稳定，即增加此类制剂的贮存期和/或使用时间的化学剂。为了方便， 参考 Remington :The Science and Practice of Pharmacy，第 19 片反，1995。本发明的胰岛素制剂可进一步包含表面活性剂。术语“表面活性剂”用于本文指包含水溶性(亲水)部分、头和脂溶性(亲脂)片段的任何分子或离子。表面活性剂优选在界面累积，亲水部分朝向水(亲水相)和亲脂部分朝向油相或疏水相(即玻璃、空气、油等)。表面活性剂开始形成胶束的浓度称为临界胶束浓度或CMC。而且，表面活性剂降低液体的表面张力。表面活性剂也称为两亲化合物。术语“去污剂”一般用作表面活性剂的同义词。表面活性剂在药用制剂中的用途为技术人员公知。为了方便，参考Remington=The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，第 19 版，1995。在进一步的实施方案中本发明涉及包含本发明胰岛素化合物的水溶液和缓冲剂的胰岛素制剂，其中所述胰岛素化合物的存在浓度是0. ImM或以上，且其中所述制剂在室温( 25°C )具有约3. 0-约8. 5的pH。本发明还涉及制备本发明胰岛素制剂的方法。
在一个实施方案中，制备本发明胰岛素制剂的方法包含a)通过使胰岛素化合物或胰岛素化合物混合物溶于水或缓冲剂中制备溶液；b)通过使二价金属离子溶于水或缓冲剂中制备溶液；c)通过使防腐剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；d)通过使等渗剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；e)通过使表面活性剂和/或稳定剂溶于水或缓冲剂中制备溶液；f)将溶液a)和溶液b)、c)、d)和e)中一种或多种混合；最后将f)混合物的pH调节至期望的pH，接着无菌过滤。本发明的胰岛素制剂可用于通过胃肠外给药治疗糖尿病。建议将给予患者的本发明胰岛素制剂的剂量由医生选择。胃肠外给药可通过皮下、肌内、腹膜内或静脉内注射通过注射器(任选笔样注射器)进行。或者，胃肠外给药可通过输注泵进行。作为进一步的选择，含有本发明胰岛素化合物的胰岛素制剂还可适应于经皮给药，如通过无针注射或由贴剂(任选离子电渗贴剂) 给药，或经黏膜如经口给药。可以将本发明的胰岛素制剂在几个部位给予需要这种治疗的患者，例如在局部部位，例如皮肤和黏膜部位，绕开吸收的部位，例如在动脉、静脉、心脏给药，和在涉及吸收的部位，例如在皮肤、皮肤下、在肌肉中或在腹中给药。在本发明一个实施方案中胰岛素制剂是水制剂，即包含水的制剂。此类制剂典型地是溶液或混悬液。在本发明进一步的实施方案中胰岛素制剂是水溶液。术语“水制剂”限定为包含至少50% w/w水的制剂。同样，术语“水溶液”限定为包含至少50% w/w水的溶液，术语“水混悬液”限定为包含至少50% w/w水的混悬液。水混悬液可含有与适合制造水混悬液的赋形剂混合的活性化合物。在一个实施方案中，本发明的胰岛素制剂非常适合应用于通过注射用于胰岛素疗法的笔样装置中。在一个实施方案中本发明的胰岛素制剂可用于胰岛素给药所用的泵中。术语胰岛素制剂的“物理稳定性”用于本文指因为蛋白质暴露于热-机械应力和/ 或与失稳的界面和表面(比如疏水表面和界面)相互作用，蛋白质形成生物学上无活性和 /或不溶性蛋白质聚集物的倾向。蛋白质水制剂的物理稳定性通过在不同温度下将填在合适容器(如药筒或瓶)中的制剂暴露于机械/物理应力(如搅动)各种时间段后，通过目测和/或浊度测量评价。制剂的目测用黑色背景在强聚焦光中进行。制剂的浊度通过例如以0-3的标度对浊度程度视觉评分而表征(不显示浊度的制剂对应于视觉评分0，在日光下显示视觉浊度的制剂对应于视觉评分幻。当制剂在日光下显示视觉浊度时，将其分类为在蛋白质聚集方面在物理上不稳定。或者，制剂的浊度可通过技术人员公知的简单浊度测量评价。蛋白质水制剂的物理稳定性还可通过使用蛋白质构象状态的分光剂或探针评价。探针优选是与蛋白质的非天然构象异构体优先结合的小分子。蛋白质结构的小分子分光探针的一个实例是Thioflavin το Thioflavin T是已被广泛用于检测淀粉样蛋白原纤维的荧光染料。在原纤维以及可能其它蛋白质构型的存在下，Thioflavin T与原纤维蛋白形式结合时在约450nm产生新的激发最大值，在约482nm产生增强的发射。未结合的Thioflavin T在所述波长基本无荧光。
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术语蛋白质制剂的“化学稳定性”用于本文指共价蛋白质结构的改变，其导致形成化学降解产物，所述产物与天然蛋白质结构相比具有潜在的更小生物学潜能和/或潜在的增加的免疫原性性质。可形成各种化学降解产物，取决于天然蛋白质的类型和性能和蛋白质暴露的环境。在蛋白质制剂的贮存和使用过程中经常看到化学降解产物的量增加。大多数蛋白质容易脱酰胺，这是在谷氨酰基或天冬酰胺基残基中的侧链酰胺基水解形成游离羧酸或天冬酰胺基残基水解形成IsoAsp衍生物的过程。其它降解途径包括形成高分子量产物，其中两个或更多个蛋白质分子相互之间通过转酰氨基作用和/或二硫化物相互作用共价结合，导致形成共价结合的二聚体、低聚物和聚合物降解产物(lability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. Τ. J. & Manning Μ. C. , Plenum Press, New York 1992)。可提及氧化(例如蛋氨酸残基的氧化)作为化学降解的另一种变体。蛋白质制剂的化学稳定性可通过在暴露于不同环境条件(经常通过例如增加温度加速降解产物的形成)后在各个时间点测量化学降解产物的量评价。每种个别降解产物的量经常通过根据分子尺寸和/或电荷用各种色谱技术(如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物确定。因为HMWP产物为潜在免疫原性和无生物学活性，所以低HMWP水平是有利的。术语“稳定的制剂”指具有增加的物理稳定性、增加的化学稳定性或增加的物理和化学稳定性的制剂。一般来讲，制剂在使用和贮存(依照推荐的使用和贮存条件)过程中必须稳定直至达到有效期。术语“糖尿病(diabetes) ”或“糖尿病(diabetes mellitus) ”包括1型糖尿病、2 型糖尿病、妊娠糖尿病(在怀孕过程中)及其它引起高血糖症的病况。该术语用于代谢病症，其中胰腺产生不足量胰岛素，或者其中机体细胞对胰岛素不能适当应答由此妨碍细胞吸收葡萄糖。结果，葡萄糖在血液中积累。1型糖尿病，也称为胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)和青少年型糖尿病，由B-细胞破坏引起，通常导致绝对的胰岛素缺乏。2型糖尿病，也称为非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)和成人型糖尿病，主要与胰岛素抵抗因此相对胰岛素缺乏和/或胰岛素分泌不足为主伴有胰岛素抵抗有关。术语“药学上可接受的”用于本文指适合正常药学应用，即不在患者中产生任何严重的不良事件。术语“治疗疾病”用于本文指管理和护理已发生疾病、病况或病症的患者，包括治疗、预防或缓解疾病。治疗的目的是对抗疾病、病况或病症。治疗包括给予活性化合物以消除或控制疾病、病况或病症以及缓解疾病、病况或病症关联的症状或并发症，和预防疾病、 病况或病症。在另一个实施方案中，本发明的胰岛素类似物作为药物用于延迟或预防2型糖尿病的疾病进展。在本发明一个实施方案中，提供本发明的胰岛素制剂作为药物用于治疗或预防高血糖症，包括应激诱发的高血糖症，2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病和烧伤、手术创伤及其它在治疗中需要合成代谢效果的疾病或损伤、心肌梗死、中风、冠心病及其它心血
管病症。在本发明又一个实施方案中，提供治疗或预防高血糖症的方法，所述高血糖症包括应激诱发的高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病和烧伤、手术创伤及其它在治疗中需要合成代谢效果的疾病或损伤、心肌梗死、冠心病及其它心血管病症、中风，所述方法包含给予需要这种治疗的患者有效量的本发明胰岛素制剂用于这种治疗。用本发明胰岛素制剂治疗还可与第二种或更多种药理学活性物组合，如选自抗糖尿病剂、减肥剂、食欲调节剂、抗高血压剂、治疗和/或预防糖尿病导致或与糖尿病关联的并发症的药剂和治疗和/或预防肥胖症导致或与肥胖症关联的并发症和病症的药剂。用本发明胰岛素制剂治疗还可与肥胖病学手术(影响葡萄糖水平和/或脂质稳态的手术比如胃囊带术或胃旁路术)组合。多肽如胰岛素的制备在本领域公知。本发明的胰岛素类似物可以例如通过经典肽合成(如使用t-Boc或Fmoc化学的固相肽合成)或其它良好确定的技术制备，参见例如 Greene禾口Wuts，“Protective Groups in Organic Synthesis”，John Wiley & Sons，1999。 胰岛素类似物还可通过以下方法制备，该方法包含在允许胰岛素类似物表达的条件下在合适的营养培养基中培养含有编码该类似物的DNA序列和能够表达该胰岛素类似物的宿主细胞。对于包含非天然氨基酸残基的胰岛素类似物，应当修饰重组细胞以便将非天然氨基酸并入类似物内，例如通过使用tRNA突变体。因此，简言之，本发明的胰岛素类似物类似于已知胰岛素类似物的制备而制备。几种方法可用于制备人胰岛素和人胰岛素类似物。例如用于在微生物中制备胰岛素的三种主要方法公开于W02008034881。其中两种涉及大肠杆菌，或者在细胞质 ^ ^ & (Frank^ (1981), Peptides =Proceedings of the 7th American Peptide Chemistry Symposium (Rich & Gross, eds. ), Pierce Chemical Co. , Rockford, 111. PP 7四-739)，或者使用信号肽以允许分泌进入周质间隙(Chan等(1981)PNAS 78: M01-5404)。第三种方法利用啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)分泌胰岛素前体进入培养基内(Thim等(1986)PNAS 83:6766-6770)。现有技术公开大量在大肠杆菌或啤酒酵母中表达的胰岛素前体，参阅 U. S5, 962，洸7、WO 95/16708、EP 0055945、EP 0163529、EP 0347845 和 EP0741188。胰岛素类似物通过在合适的宿主细胞中通过公知技术表达DNA序列(其编码讨论之中的胰岛素类似物)制备，如例如US 6500645公开。胰岛素类似物直接表达或作为前体分子表达，所述前体分子在B-链上具有N-端延伸或在B-链上具有C-端延伸。N-端延伸可具有增加直接表达的产物的收率的功能，可长为至多15个氨基酸残基。N-端延伸将在从培养肉汤中离析后体外分裂，因此将具有紧靠Bl的分裂位点。类型适合本发明的N-端延伸公开于US 5，395，922和EP 765，395。C-端延伸可具有保护成熟胰岛素或胰岛素类似物分子免受宿主细胞外蛋白酶的细胞内解蛋白处理的功能。C-端延伸将在培养肉汤中通过分泌的活性羧肽酶在细胞外分裂或者在从培养肉汤中离析后体外分裂。在B-链上具有通过羧肽酶脱除的C-端延伸的成熟胰岛素和胰岛素类似物的制备方法公开于WO 08037735。 该方法的目标胰岛素产物可以是双链人胰岛素或双链人胰岛素类似物，其可在B-链上具有或可不具有短的C-端延伸。如果目标胰岛素产物没有B-链的C-端延伸，则所述C-端延伸应当能够随后在进一步纯化步骤之前从B-链分裂。本发明还考虑实施方案的下列非限制性列举，它们在本文其它地方进一步描述1. 一种胰岛素制剂，其包含 胰岛素化合物，
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烟碱化合物，和 精氨酸。2.实施方案1的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物是人胰岛素或胰岛素类似物。3.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物是B28Asp人胰岛素。4.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物是B28LysB29Pr0人
胰岛素。5.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物是B3LysB^Glu人胰岛素。6.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在范围选自 0. 1-10. OmM ；0. 1-3. OmM ；0. 1-2. 5mM ；0. 1-2. OmM ；0. 1-1. 5mM ；0. 2-2. 5mM ；0. 2-2. OmM ； 0. 2-1. 5mM ；0. 3-3. OmM ；0. 3-2. 5mM ；0. 3-2. OmM ；0. 3-1. 5mM ；0. 5-1. 3mM 和 0. 6-1. 2mM。7.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. ImM-约 10. OmM。8.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. ImM-约 3. OmM。9.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. ImM-约 2. 5mM。10.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. ImM-约 2. OmM011.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. ImM-约 1. 5mMo12.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 2mM-约 2. 5mM013.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 2mM-约 2. OmM014.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 2mM-约 1. 5mM015.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 3mM-约 3. OmM016.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 3mM-约 2. 5mM017.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 3mM-约 2. OmM018.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 3mM-约 1. 5mM019.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 5mM-约 1. 3mM020.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 3mM-约 1. 2mM0
21.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 6mM-约 1. 2mM022.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约0.6 或约1. 2mM。23.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约 0. 3mM。24.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约
0.6mM。25.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中胰岛素化合物的存在量为约
1.2mM。26.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物选自烟酰胺、烟酸、尼克酸、尼克酰胺和维生素B3和/或其盐和/或其任何组合。27.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物选自烟酰胺和烟酸和 /或其盐和/或其任何组合。28.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中烟碱化合物的存在范围选自 l-300mM ；5-200mM ；40-120mM、70-140mM 或 80_130mM。29.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约ImM-约300mM烟碱化合物。30.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8mM_约^OmM烟碱化合物。31.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5mM_约200mM烟碱化合物。32.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约ImM-约150mM烟碱化合物。33.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5mM_约20mM烟碱化合物。34.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20mM_约120mM烟碱化合物。35.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约40mM_约120mM烟碱化合物。36.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20mM_约40mM烟碱化合物。37.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约60mM_约80mM烟碱化合物。38.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约70mM_约140mM烟碱化合物。39.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约80mM_约130mM烟碱化合物。40.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8mM、30mM、100mM或130mM烟碱化合物。41.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约SmM烟碱化合物。42.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30mM、IOOmM或130mM烟碱化合物。43.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30mM烟碱化合物。44.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约IOOmM烟碱化合物。45.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约130mM烟碱化合物。46.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约150mM烟碱化合物。47.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含下列范围的精氨酸化合物 l-100mM、5-120mM、8-85mM、20-90mM、30-90mM、30-85mM、30-60mM 或 10_40mM。48.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含下列范围的精氨酸化合物l-120mM、8-85mM 或 l_40mM。49.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约ImM-约120mM精氨酸。50.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约ImM-约IOOmM精氨酸。51.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5mM_约120mM精氨酸。52.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20mM_约90mM精氨酸。53.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30mM_约85mM精氨酸。54.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约8mM-约85mM精氨酸。55.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30mM_约60mM精氨酸。56.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约IOmM-约40mM精氨酸。57.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约ImM-约40mM精氨酸。58.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中精氨酸的存在范围选自lmM、 2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM or 40mM、45mM、 50mM、55mM 或60mM。59.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约ImM精氨酸。60.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约2mM精氨酸。61.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约3mM精氨酸。62.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约4mM精氨酸。63.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约5mM精氨酸。64.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约6mM精氨酸。65.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约7mM精氨酸。66.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约SmM精氨酸。67.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约9mM精氨酸。68.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约IOmM精氨酸。69.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约15mM精氨酸。70.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约20mM精氨酸。71.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约25mM精氨酸。72.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约30mM精氨酸。73.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约35mM精氨酸。74.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约40mM精氨酸。75.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约45mM精氨酸。76.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约50mM精氨酸。77.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约55mM精氨酸。78.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其包含约60mM精氨酸。79.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其进一步包含谷氨酸。80.实施方案79的胰岛素制剂，其中谷氨酸的存在范围选自l-100mM、20-90mM、 30-90mM、30-85mM 或 30_50mM。81.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约ImM-约IOOmM谷氨酸。82.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约20mM_约90mM谷氨酸。83.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约30mM_约85mM谷氨酸。
84.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约30mM_约50mM谷氨酸。85.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约30mM或50mM谷氨酸。86.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约30mM谷氨酸。87.实施方案79的胰岛素制剂，其包含约50mM谷氨酸。88.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其进一步包含金属离子、防腐剂、等渗剂和稳定剂、去污剂和缓冲剂。89.实施方案88的胰岛素制剂，其中所述缓冲剂是三羟甲基氨基甲烷。90.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约2mM-约50mM三羟甲基氨基甲烷。91.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约IOmM-约40mM三羟甲基氨基甲烷。92.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约20mM_约30mM三羟甲基氨基甲烷。93.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约10mM、20mM、30mM或40mM三羟甲基氨基甲烷。94.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约IOmM三羟甲基氨基甲烷。95.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约20mM三羟甲基氨基甲烷。96.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约30mM三羟甲基氨基甲烷。97.实施方案89的胰岛素制剂，其包含约40mM三羟甲基氨基甲烷。98.实施方案89的胰岛素制剂，其中金属离子是锌。99.实施方案98的胰岛素制剂，其中每个胰岛素化合物六聚体存在小于约6个锌
1 子。100.实施方案98的胰岛素制剂，其中每个胰岛素化合物六聚体存在小于约4个锌
1 子。101.实施方案98的胰岛素制剂，其中每个胰岛素化合物六聚体存在小于约3个锌
1 子。102.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约2 6-约5 6。103.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约2. 5 6_约 4. 5 6。104.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约3 6-约4 6。105.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约2 6。106.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约2. 5 6。107.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约3 6。108.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约3. 5 6。109.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约4 6。110.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约4. 5 6。111.实施方案98的胰岛素制剂，其中锌胰岛素摩尔比为约5 6。112.实施方案88的胰岛素制剂，其中稳定剂是非离子去污剂。113.实施方案112的胰岛素制剂，其中去污剂是聚山梨醇酯20(TWeen 20)或聚山梨醇酯 80 (Tween 80)。114.实施方案112的胰岛素制剂，其中去污剂是聚山梨醇酯20 (Tween 20)。115.实施方案112的胰岛素制剂，其中去污剂是聚山梨醇酯80 (Tween 80)。
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116.实施方案112-115中任一项的胰岛素制剂，其包含约5-100ppm、约10-约 50ppm或者约10-约20ppm聚山梨醇酯。117.实施方案88的胰岛素制剂，其进一步包含酚化合物。118.实施方案117的胰岛素制剂，其中所述酚化合物的存在量为约0_约6mg/ml 或者约0-约細g/ml。119.实施方案88的胰岛素制剂，其进一步包含间甲酚。120.实施方案119的胰岛素制剂，其中间甲酚的存在量为约0. 5_约4. Omg/ml或者约 0. 6-约 4. Omg/ml。121.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中PH是中性至弱碱性。122.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 0_约8. 0。123.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7.0。124.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 1。125.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 2。126.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 3。127.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 4。128.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 5。129.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 6。130.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 7。131.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 8。132.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约7. 9。133.先前实施方案中任一项的胰岛素制剂，其中pH为约8.0。134. 一种通过给予需要这种治疗的患者治疗活性剂量的前述实施方案中任一项的胰岛素制剂降低哺乳动物血糖水平的方法。135. 一种治疗受试者糖尿病的方法，其包含给予受试者前述实施方案中任一项的胰岛素制剂。136.前述实施方案中任一项的方法，其用于胃肠外给药。137.前述实施方案中任一项的胰岛素制剂，其用于治疗或预防高血糖症，所述高血糖症包括应激诱发的高血糖症、2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、1型糖尿病，和烧伤、手术创伤及其它在治疗中需要合成代谢效果的疾病或损伤、心肌梗死、中风、冠心病及其它心血管病症，和用于治疗病危糖尿病和非糖尿病患者。通过下列实施例进一步说明本发明，所述实施例不应视为限制性。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用全部结合到本文中，如同将每个参考文献个别和具体地指出通过引用结合并在本文将其完全阐述的程度 (达到法律允许的最大程度)。所有标题和子标题用于本文只是为了方便，不应视为以任何方式限制本发明。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(如“比如”)的使用，只是旨在更好地阐述本发明，对本发明的范围没有限制，除非另外请求保护。说明书中的语言不应视为指出将任何未请求保护的元素为本发明实施所必需。本文引用和结合专利文件只是为了方便而完成，不反映此类专利文件的有效性、可专利性和/或可实施性的任何意见。本发明包括适用的法律允许的在其附属权利要求中叙述的主题的所有修改和等价。
实施例实施例1药用制剂的制备可将本发明的药用制剂配制为水溶液。例如用氯化钠或甘油使水性培养基等渗。
而且，水性培养基可含有锌离子(例如作为乙酸锌或氯化锌加入)、缓冲剂和防腐剂。精氨
酸可作为Arg，HCl加入。将制剂的pH值调节至期望的值，可为约3-约8. 5、约3-约5或
约6. 5-约7. 5，这取决于讨论之中的胰岛素的等电点，pi。表1.本发明胰岛素制剂的组成


包含一种胰岛素化合物或者两种或更多种胰岛素化合物的混合物、烟碱化合物和氨基酸的胰岛素制剂。