钽涂层多级孔聚醚醚酮人工骨支架的3d打印制造方法【技术领域】，涉及钽涂层多级孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，属于生物制造领域，是机械工程，信息，组织工程，生命科学交叉的领域。[0002]骨骼是人体的支架，担负着支持、保护、承重、造血、贮钙等功能，是人体重要的组织。临床上常由创伤、感染、先天性缺陷等原因导致骨缺损，这些是骨科每天都面临的治疗问题。用人工材料制造人工骨，填补骨缺陷位置，是一种十分理想的修复方式。人工骨是用人工材料制造的人骨替代品。理想的人工骨要具有良好的骨传导、骨诱导及骨生成作用。随着对人工骨研究的深入，人工骨的功能不仅仅停留在对骨缺损的替换，而更多的是仿制人体骨骼复杂的非均质多孔结构，进而增大人工骨的生物活性的表面积，从而增强成骨细胞的粘附作用，保证与人体骨骼的可靠长合。为提升人工骨与成骨细胞的接触面积，现有的人工骨大多采用多孔的支架结构。美国的Zimmer公司生产的小梁金属就是这其中的代表。但是现有的人工骨的多孔支架结构，其孔的结构单一，孔径固定不变，支架孔隙很难完全贯通，这就导致了制备的人工骨支架与人体骨骼差异大，且生物相容性较差，生物活性低，成骨细胞难以粘附。现有多种人工骨支架典型的制造方法:纤维粘接技术，微粒浙滤技术，气体发泡技术，相分离技术。这些方法均存在着一定的缺陷:(I)在制造过程中都经历高温、高压过程或使用了有机溶剂，这对生物活性是非常有害的；(2)难以成形200μπι以上的可控孔隙结构；(3)难以保证孔隙之间的完全贯通；(4)难以实现具有孔隙梯度的多级孔结构和材料梯度结构的成形；(5)难以实现个性化制造。[0003]聚醚醚酮是由英国ICI公司于1977年率先开发出的一种新型工程塑料，其既具有热固性塑料的耐高温性能、优异的机械强度(高强度、高弹性模量、高断裂韧性)、化学稳定性、耐辐射性能，又具有热塑 性材料的易加工性。聚醚醚酮材料和用于制造人工骨的金属材料相比，其弹性模量和人骨弹性模量更接近，这就保证了用聚醚醚酮制备的人工骨和人体骨骼弹性模量相近，从而解决了金属材料人工骨因与人体骨骼弹性模量差距过大而造成的应力遮挡、骨吸收、骨发炎、二次手术等问题。聚醚醚酮材料其韧性和刚性兼备，特别是它对交变应力的优良耐疲劳特性，可以制成具有长疲劳寿命的人工骨支架。并且聚醚醚酮具有优良生物相容性，无细胞毒性，是一种临床可植入材料。[0004]钽金属无细胞毒性，生物体内呈惰性,具有良好生物相容性,生物活性高,其使用历史可以追溯到20世纪中期，当时有许多医疗器械就已经采用这种材料进行制作，例如颅骨成形术中使用的金属板，目前钽金属植入物已经在骨科、颅面部等方面广泛使用。[0005]现有人工骨支架孔结构受到加工方式的限制，无法做出较深的、孔隙率可以渐变的多级孔结构。采用3D打印技术，可以制造出符合人体骨骼微观结构的，极其复杂非均质的多级孔结构，保证孔隙的贯通和孔隙率的可调性。现有的人工骨支架制造过程中，均涉及高温、高压过程并使用了大量的有机溶剂，而采用3D打印技术打印聚醚醚酮所制造的支架，可避免这些缺点，保证人工骨支架植入人体内的安全。
[0006]本发明的目的在于提供钽涂层多级孔聚醚醚酮人工骨支架的3D打印制造方法，解决了现有材料在人工骨支架制造过程中，大部分涉及高温高压过程并使用了大量的对人体有害的有机溶剂问题，实现了具有较高生物活性，与人体骨骼力学性能接近，满足个体差异的人工骨的制备。[0007]本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行:
[0008]步骤1、采用CT扫描人体损伤处的骨组织，缺失处骨组织可扫描对称部位的组织结构，获取损伤骨组织图像数据；
[0009]步骤2、将扫描获取的损伤骨组织的图像数据导入Mimics软件，建立人体指定部位的骨骼三维模型；
[0010]步骤3、将骨骼三维模型以STL格式输入到3D打印系统；
[0011]步骤4、启动聚醚醚酮3D打印系统，采用聚醚醚酮为原材料，通过温控系统对3D打印系统喷头、成形基板、打印室进行预热，送丝速度设定为15-25mm/min,层厚设定为
0.1-0.3mm ;
[0012]步骤5、利用3D打印系统进行聚醚醚酮人工骨支架的打印。在第一层的打印过程中，运动速度为送丝速度的60%，保证打印件和基板的有效粘接。完成第一层打印后，喷头上升0.1-0.3mm，进行第二层打印，打印过程中先走出一圈较密实的外轮廓，保证生成人工骨支架后有较好的结构强度和外形精度，之后再打印内部结构。每完成一层后，喷头上升
0.1-0.3mm,进行下一层的打印,直至完成整个人工骨支架的制造过程。悬空部位的支架底层需采用水溶性支撑材料进行打印；
[0013]步骤6、将打印室温度冷却到室温，然后再从打印室中取出聚醚醚酮人工骨支架；
[0014]步骤7、将打印好的支架放入超声波清洗机中用碱性溶液清洗，直至去除支撑材料，然后分别用丙酮，无水乙醇，去离子水超声波清洗，高纯N2吹干；
[0015]步骤8、将干燥好的人工骨支架放入磁控溅射仪的溅射室腔体内，用银胶粘贴到载物台上，为采用磁控溅射技术在人工骨支架上镀钽涂层做准备；
[0016]步骤9、接通电源和冷却水,抽真空到5χ 10-5-1χKT4Pa ；
[0017]步骤10、打开进气阀，向派射室内通入Ar气。当真空计示数达到0.3~0.8Pa时，打开各靶对应的直流电源，使靶起辉，预溅射10-20分钟，清除靶材表面杂质及氧化层；
[0018]步骤11、调节功率(80-300W)进行溅射，待辉光正常后，打开挡板，将样品加热，并旋转台旋转，开始镀钽涂层；
[0019]步骤12、镀钽涂层时间30min~60min，镀钽涂层完毕后，溅射室放气，关闭电源，取出人工骨支架，将钽涂层多级孔聚醚醚酮支架进行消毒处理后完成全部步骤。
[0020]进一步，步骤I中CT扫描采用医用的3D_MicroCT、MRI等其他医学图像采集设备。
[0021]进一步，步骤4中所使用聚醚醚酮为丝状聚醚醚酮或粒状聚醚醚酮，所用的材料为碳纤维增强聚醚醚酮或玻璃纤维聚醚醚酮。
[0022]进一步，步骤4中，打印系统喷头预热温度340°C~365°C ;成形基板预热到110°C~130°C ;打印室预热到180°C~230°C。
[0023]进一步，步骤6中将打印室温度以5°C -1O0C /min的速度逐渐冷却到室温。[0024]进一步，人工骨支架钽金属涂层的制备，所用的方法可以为化学气相沉积法或热喷涂等物理气相沉积法。
[0025]本发明的有益效果是通过3D打印制作人工骨支架，使制作的支架对人体无害。



[0026]图1是本发明Hoechst33342染色观察细胞培养24h细胞核形态对比图；
[0027]图2是本发明Westernblot方法检测检测Bcl_2、Bax和β -actin蛋白表达图；
[0028]图3是本发明Westernblot方法检测检测Bcl_2、Bax蛋白表达分析图。

[0029]下面结合附图和对本发明进行详细说明。
[0030]理想的人工骨支架要具有以下的特点:(I)生物理化性质方面:①良好的生物相容性，无不可接受的细胞毒性、免疫排斥和炎症反应；②高的比表面积、合适的表面理化性质，可以吸附并结合诱导剂、细胞因子和生长因子等，以利于细胞的粘附、增殖以及分化。
(2)结构特点方面:①特定的结构外形，以获得所需组织或器官的形状合适的孔径尺寸、高的孔隙率和高度贯通的孔隙结构，以利于氧分、营养物质与代谢产物的交换，为细胞的大量种植和增殖、细胞外基质的分泌、以及血管和神经的内生长提供空间和环境。(3)力学性能方面:与植入部位组织相匹配的力学强度，能为细胞提供合适的微应力环境，并在体内力学微环境中保持结构稳定性和完整性。
[0031]本发明结合医用MicroCT和采用3D打印技术,可以实现个性化制造,满足不同个体的需要。为增强聚醚醚酮人工骨支架植入人体后骨细胞生长、增殖和成骨分化的需要，采用物理气相沉积(PVD)技术将钽涂覆于聚醚醚酮3D打印人工骨支架表面，提高人工骨支架的生物相容性，增强骨支架与人体软/硬组织的结合强度。
[0032]本发明的具体步骤如下:
[0033]步骤1、采用医用CT扫描人体损伤处的骨组织，缺失处骨组织可扫描对称部位的组织结构，获取损伤骨组织图像数据。所用的医学数据采集可以用3D-Micix)CT、MRI等其他医学图像采集设备。
[0034]步骤2、将扫描获取的损伤骨图像数据导入Mimics软件，Mimics软件是医学图像(如CT、MRI图像)和CAD设计之间的桥梁。通过软件测量缺损骨骼的数据以确定人工骨支架的尺寸，根据统计分析结果和测量结果，通过对比增强、平滑处理等创建缺损骨骼的三维模型，根据该三维模型制备聚醚醚酮多级孔人工骨支架。
[0035]步骤3、将骨骼三维模型以STL格式输入到3D打印系统控制软件中，软件根据参数设置，将三维模型的数据进行分层切片处理，并将每层的数据变换成运动轨迹代码。
[0036]步骤4、启动聚醚醚酮3D打印系统，采用聚醚醚酮为原材料，通过温控系统将3D打印系统喷头预热到T1 (340°C~365°C )，成形基板预热到T2 (110°C~130°C )，打印室预热到T3(180°C~230°C )。 送丝速度设定为15-25mm/min，层厚设定为0.1-0.3mm。聚醚醚酮为丝状聚醚醚酮原材料但不局限为丝状，也可以是粒状聚醚醚酮原材料或其他，所用的材料可以为碳纤维增强聚醚醚酮或玻璃纤维聚醚醚酮。
[0037]步骤5、采用3D打印机进行聚醚醚酮人工骨支架的打印。在第一层的打印过程中，运动速度为送丝速度的60%，保证打印件和成形基板的有效粘接。完成第一层打印后，喷头上升0.1-0.3mm，进行第二层打印，打印过程中先走出一圈较密实的外轮廓，保证生成人工骨支架后有较好的结构强度和外形精度，之后再在内圈打印出具有多级孔隙率的微结构。每完成一层后，喷头上升0.1-0.3mm，进行下一层的打印，直至完成整个人工骨支架的制造过程。悬空部位的支架底层需采用水溶性支撑材料进行打印，起到支撑的作用，以保证下一层支架的顺利成形。
[0038]步骤6、将打印室温度T3由180°C~230°C以5°C _10°C /min的速度逐渐冷却到室温，然后再从打印室中取出多级孔聚醚醚酮人工骨支架。
[0039]步骤7、取出打印完的支架，放入超声波清洗机中用碱性溶液清洗，直至去除支撑材料。将去掉支撑的人工骨支架先后在丙酮和乙醇溶液中超声清洗20min，再用去离子水超声清洗20min，最后用高纯N2吹干。
[0040]步骤8、用乙醇擦拭磁控溅射仪的溅射室，安装钽靶，将干燥好的人工骨支架放入磁控溅射仪的溅射室腔体内，用银胶粘贴到载物台上，为采用磁控溅射技术在人工骨支架上镀钽涂层做准备。
[0041]步骤9、分子泵、各磁控靶接通冷却水，接通电源，压缩空气泵工作，启动机械泵，预抽溅射室至4Pa，复合真空计示数到达4Pa时，启动分子泵，抽至5xl0_5~1χ10_4 (大概半小时)，准备镀钽涂层。
[0042]步骤10、打开气瓶,打开进气阀，向派射室内通入Ar气，当真空计示数达到0.3~
0.8Pa时，打开各靶对应的直流电源，使靶起辉，预溅射10~20分钟，清除靶材表面杂质及
氧化层。
[0043]步骤11、调节不同功率(80~300W)进行溅射，待辉光正常后，打开挡板，样品加热，旋转台旋转，镀钽涂层开始，此后镀膜时间、样品换位均由计算机控制。镀钽涂层30min~60min,由涂层厚度确定。
[0044]步骤12、镀钽涂层完毕，溅射室放气完毕，关闭电源，取出人工骨支架，将钽涂层多级孔聚醚醚酮支架进行消毒处理，完成全部步骤。
[0045]上述本发明的人工骨支架钽金属涂层的制备，所用的方法可以为化学气相沉积法或热喷涂等物理气相沉积法。本发明制造的多级孔聚醚醚酮人工骨支架，通过改变孔隙率，调节人工骨支架弹性模量，使之与人体皮质骨弹性模量更好的匹配。针对现有人工骨支架机械性能方面的缺陷，采用新型特种工程塑料聚醚醚酮作为本发明制备人工骨支架材料，解决金属材料(如钛合金)制备的人工骨支架弹性模量较人体骨骼有较大差异所导致的，植入人体后产生应力遮挡、骨吸收、骨发炎等问题；解决现有材料制备的人工骨支架疲劳强度不足、易老化、易产生断裂破坏等问题。本发明的人工骨支架可以通过改变孔隙率，调节人工骨支架弹性模量，使之与人体骨骼弹性模量更好的匹配，韧性和强度高。本发明采用磁控溅射技术，将钽涂覆在人工骨支架的表面，提高了人工骨支架的生物相容性。本方法的模型更接近人体骨骼生理解剖结构，本发明采用的聚醚醚酮人工骨支架的强度更高，且采用了生物相容性非常好的惰性材料钽进行表面涂覆，具有非常好的强度和生物相容性。
[0046]以下为具体实施例对本发明进行说明:
[0047]实例1:
[0048] 步骤1、采用医用CT扫描人体损伤处的骨组织，缺失处骨组织可扫描对称部位的组织结构，获取损伤骨组织图像数据。所用的医学数据采集可以用3D-Micix)CT、MRI等其他医学图像采集设备。
[0049]步骤2、将扫描获取的损伤骨外形的图像数据导入Mimics软件，Mimics软件是医学图像(如CT、MRI图像)和CAD设计之间的桥梁。通过软件测量缺损骨骼的数据以确定人工骨支架的尺寸，根据统计分析结果和测量结果，通过对比增强、平滑处理创建缺损骨骼的三维模型，根据该三维模型制备聚醚醚酮多级孔人工骨支架。
[0050]步骤3、将骨骼三维模型以STL格式输入到3D打印系统中，软件根据参数设置，将三维模型的数据进行分层切片处理，并将每层的数据，变换成运动轨迹代码。
[0051]步骤4、启动聚醚醚酮3D打印机，采用直径为1.65mm丝状聚醚醚酮为原材料，通过温控系统将3D打印系统喷头预热到360°C，成形基板预热到120°C，打印室预热到200°C。送丝速度设定为25mm/min,层厚设定为0.3mm。
[0052]步骤5、利用3D打印机进行聚醚醚酮人工骨支架的打印。在第一层的打印过程中，运动速度为送丝速度的60%，保证打印件和成形基板的有效粘接。完成第一层打印后，喷头上升0.3mm，进行第二层打印，打印过程中先打印出一圈较密实的外轮廓，保证生成人工骨支架后有较好的结构强度和外形精度。之后再在内圈打印出具有多级孔隙率的微结构。每完成一层后，喷头上升0.3mm，进行下一层的打印，直至完成整个人工骨支架的制造过程。悬空部位的支架底层需采用水溶性支撑材料进行打印，起到支撑的作用，以保证下一层支架的顺利成形。
[0053]步骤6、将打印室温度T3由200°C以8°C /min的速度逐渐冷却到室温，然后再从打印室中取出多级孔 聚醚醚酮人工骨支架。
[0054]步骤7、取出打印完的支架，放入超声波清洗机中用碱性溶液清洗，直至去除掉支撑材料。将去掉支撑的聚醚醚酮人工骨支架先后在丙酮和乙醇溶液中超声清洗20min，再用去离子水超声清洗20min，最后用高纯N2吹干。
[0055]步骤8、用乙醇擦拭磁控溅射仪的溅射室，安装钽靶，将干燥好的人工骨支架放入磁控溅射仪的溅射室腔体内，用银胶粘贴到载物台上，为采用磁控溅射技术在人工骨支架上镀钽涂层做准备。
[0056]步骤9、分子泵、各磁控靶接通冷却水，接通电源，压缩空气泵工作，启动机械泵，预抽溅射室至4Pa，复合真空计示数到达4Pa时，启动分子泵，抽至5xl0_5，准备镀钽涂层。
[0057]步骤10、打开气瓶,打开进气阀，向派射室内通入Ar气，当真空计示数达到0.6Pa时，打开各靶对应的直流电源，使靶起辉，预溅射10分钟，清除靶材表面杂质及氧化层。
[0058]步骤11、调节功率150W进行溅射，待辉光正常后，打开挡板，样品加热，旋转台旋转，镀钽涂层开始，此后镀膜时间、样品换位均由计算机控制，镀钽涂层45min。
[0059]步骤12、镀钽涂层完毕，溅射室放气完毕，关闭电源，取出人工骨支架，将钽涂层多级孔聚醚醚酮支架进行消毒处理。
[0060]对本发明的3D打印人工骨支架进行检测实验:
[0061]实验1:聚醚醚酮3D打印支架对细胞形态的影响
[0062]HoeChst33342染色观察细胞核形态变化。在细胞发生各种形式的死亡时，细胞都会出现细胞核形态的改变。Hoechst33342染色可以直观的观察到细胞中细胞核的形态。图1中，对照组和打印支架组分别培养24h后进行Hoechst33342染色，从图上可以看出，与对照组相比，聚醚醚酮3D打印支架作用细胞24h，细胞核形态无明显影响，也就是细胞生长状态正常。
[0063]实验方法:a、离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟(可4°C过夜)。b、离心去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟。C、最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。d、稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。e、均匀滴上
0.5mlHoechst33342染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。f、用PBS或
0.9% NaCl洗两遍，每次3分钟。g、滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。h、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。
[0064]实验2 =Westernblot检测聚醚醚酮3D打印支架对细胞凋亡蛋白表达的影响,如图2所示，Westernblot方法检测Bcl_2、Bax蛋白表达图，图3为Westernblot方法检测检测Bcl-2、Bax蛋白表达分析图。Bcl_2、Bax是细胞凋亡(细胞死亡的一种方式)的标志性蛋白，如果发生凋亡，随着时间的变化，应该出现的是Bcl-2逐渐降低，Bax逐渐升高，本实验在钽涂层多孔聚醚醚酮人工骨支架作用的48h内，未出现Bax/Bcl-2比值增高的现象，初步说明，聚醚醚酮对细胞没有毒性。
[0065]实验方法:1.收集蛋白样品。在培养瓶中用加入3ml4°C预冷的PBS，摇动lmin，弃去洗液，重复三次。加入400 μ I含PMSF的裂解液，在冰上裂解30min。将裂解完成的细胞和裂解液离心5min，将离心后的上清分装转移倒0.5ml的离心管中放于零下20°C保存。
2.电泳。电泳时间一般4~5h，电压为40V。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。3.转膜。4.一抗孵育。室温下孵育I~2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次IOmin ;再用TBS洗一次，lOmin。5.二抗孵育。室温下孵育I~2h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次IOmin ;再用TBS洗一次，lOmin，进行化学发光反应。6.化学发光，显影，定影。7.凝胶图象分析。
[0066]实验3 =SEM表征分析聚醚醚酮3D打印支架附着细胞形态。
[0067]实验方法:a、用0.1mol/L的PBS缓冲溶液将培养细胞的材料冲洗三次，每次IOmin ;b、用2.5%的戊二醛固定2h ;c、固定后用PBS缓冲溶液冲洗三次，每次IOmin ;d、乙醇梯度脱水(10%，20%，40%，70%每次 5min，90% IOmin, 100% 15min) ;e、在干燥塔中自然干燥2h ;f、真空干燥2h ;g、离子溅射仪喷金后用扫描电子显微镜观察并拍照。
[0068] 由上述实验看出，本发明采用3D打印技术制备的钽涂层多级孔聚醚醚酮人工骨支架具有优良生物相容性，无毒无害。