专利名称：克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)是一种革兰氏阴性细菌，是克雷伯氏菌属(Klebsiella)的模式种，属于肠杆菌科。克雷伯氏肺炎杆菌目前主要作为2，3_ 丁二醇和1，3_丙二醇等化学品的生产用菌，同时，克雷伯氏肺炎杆菌可以代谢合成3-羟基丙醛、乙醇、乙偶姻、琥珀酸、乙酸、乳酸、氢气等化学品，克雷伯氏肺炎杆菌还可以作为宿主细胞构建3-羟基丙酸等化合物生产菌，使得克雷伯氏肺炎杆菌成为一种具有广阔工业化应用前景的微生物。克雷伯氏肺炎杆菌与大肠杆菌亲缘关系比较近，有些大肠杆菌中使用的基因操作方法能应用到克雷伯氏肺炎杆菌。但是克雷伯氏肺炎杆菌特殊的细胞结构和遗传背景，使得克雷伯氏肺炎杆菌中没有高效的基因重组方法。目前已有的应用于克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法有利用质粒结合法和线性质粒转化法。质粒结合法利用接合方法从大肠杆菌向克雷伯氏菌属细菌中引入自杀性质粒， 使得处于质粒上的序列与染色体上的同源序列发生重组。利用该方法Guo等将自杀性质粒导入到克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366菌株，进而通过同源重组获得了荚膜多糖合成基因 orf3 的插入突变菌株[Guo, N. N.，et al.，Consequences of cps mutation of Klebsiella pneumoniae on 1，3-propanediol fermentation. Applied microbiology and biotechnology，2010. 86 (2) :p. 701-707]，同样利用该方法Xu等在克雷伯氏肺炎杆菌 HR526 中敲除了乳酸脱氢酶基因[Xu, Y.Z.，et al.，Metabolism in 1, 3-propanediol fed-batch fermentation by a D-Iactate deficient mutant of Klebsiella pneumoniae. Biotechnology and bioengineering,2009. 104(5) :p· 965-972]。Horng 等利用接合方式将自杀性质粒导入到克雷伯氏肺炎杆菌NTUH菌株中，通过同源重组成功将1，3_丙二醇合成途径氧化支路的dhaD和dhaK两个基因进行了失活[Horng，Y. Τ.， et al.Inactivation of dhaD and dhaK abolishes by-product accumulation during 1，3-propanediol production in Klebsiella pneumoniae. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2010. 37 :p. 1-10]。线性质粒转化法，利用电击转化方法向克雷伯氏肺炎杆菌转入线性化的质粒，同样利用细胞本身具有的重组功能，使得位于线性质粒上的同源序列与染色体上的序列发生重组。Seo等在克雷伯氏肺炎杆菌Cu中，将两个长度为500bp的同源臂中间插入抗性标记基因，该片段链接到质粒上在大肠杆菌中进行复制，提取质粒后再通过酶切使得质粒线性化，将该线性质粒通过电转化进入细胞内，可以利用抗性标记选择发生同源重组的菌株，利用该方法成功将菌株的甘油脱氢酶基因和1，3-丙二醇氧化还原酶基因进行了敲除 [Seo，Μ. Y.，et al.，Elimination of by-product formation during production of 1，43-propanediol in Klebsiella pneumoniae by inactivation of glycerol oxidative pathway. Applied microbiology and biotechnology,2009. 84(3) :p.527-534]。 Red重组酶是源于λ噬菌体的一种高效重组酶，在大肠杆菌中Red重组酶可以催化只有36-50bp同源序列的DNA片段发生重组，使得同源臂可以直接设计在PCR的引物上， 而不必要将目的基因克隆出来。Flp重组酶专一性的识别DNA中的FRT序列，将这个序列链接到抗性标记基因的两段，利用质粒表达的Flp重组酶，可以使得重组到宿主细胞染色体上的抗性标记通过Flp重组酶而被消除，染色体上留下一个FRT疤痕[Datsenko，K. and B. Wanner, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K—12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences,2000. 97 (12) P. 6640]。利用Red重组酶进行的同源重组技术不但可用于染色体上基因的重组，细胞中质粒上的基因同样可以进行重组，该技术改进后已经很好的应用到了链霉菌基因重组中[Gust， B. ， et al. ， PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2003. 100(4) :p. 1541]。该技术也被尝试利用在克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组中应用，但是未获成功[Wei, Χ. X. , et al. , A mini-Mu transposon-based method for multiple DNA fragment integration into bacterial genomes. Applied microbiology and biotechnology,2010. 87(4) :p.1533-1541]。发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法。该方法是一种高效、能进行多次基因重组操作的方法。为解决上述技术问题，本发明的一种克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，包括步骤1)克隆Red重组酶基因，连接于pDK6质粒的多克隆位点，命名为pDK6-red质粒；
其中，Red重组酶是源于λ噬菌体的一种重组酶，基因序列见genebank AY048746. 1 ；
pDK6质粒是一个应用于克雷伯氏菌属的表达性质粒，其中带有卡那霉素抗性基因，含有处于乳糖启动子控制下的一个多克隆位点，见[Kleiner D. , Paul W., Merrick Μ. J. (1988)Construction of multicopy expression vectors for regulated over-production of proteins in Klebsiella pneumoniae and other enteric bacteria. J. Gen. Microbiol. 134 :77,1779-1784]详细描述；
2)将pDK6-red质粒电击转化入克雷伯氏肺炎杆菌细胞中，形成含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌；
3)制备用于第一位点基因重组的DNA片段，该片段的两端含有与第一目的重组序列两端同源的同源臂，同源臂内侧连接抗性标记I基因；
4)制备含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞，培养过程中在培养基中加入IPTG (异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷)，诱导Red重组酶的表达；
5)将用于第一位点基因重组的DNA片段，通过电击转化进入制备好的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞；
6)将转化后的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞进行培养，通过所述的抗性标记I， 筛选得到重组菌株。
所述步骤6)中，筛选得到的重组菌株能够再次进行第二位点基因重组，制备过程包括
a、采用抗性标记II基因，制备用于第二位点基因重组的DNA片段，该片段的两端含有与第二目的重组序列两端同源的同源臂，同源臂内侧连接抗性标记II基因；
b、制备上述步骤6)的重组菌株的感受态细胞，培养过程中在培养基中加入IPTG， 诱导Red重组酶的表达；
C、将用于第二位点基因重组的DNA片段，通过电击转化进入制备好的感受态细胞中；
d、将转化后的感受态细胞进行培养，通过所述的抗性标记II，筛选第一位点、第二位点双位点重组菌株。
另外，根据步骤d得到的重组菌株，还可采用不同于抗性标记I基因和抗性标记II 基因的抗性标记基因，重复a_d的步骤，获得多个位点的重组菌株。
所述的抗性标记I、II基因，包括安普霉素、链霉素、四环素或氯霉素抗性基因。
另外，本发明还公开了一种消除克雷伯氏肺炎杆菌重组菌株中抗性标记基因的方法，包括
(1)克隆Red重组酶基因，连接于pDK6质粒的多克隆位点，命名为pDK6-red质粒；
(2)克隆Flp重组酶基因，连接于pDK6质粒的多克隆位点，命名为pDK6_f Ip质粒；
其中，Flp重组酶是源于酵母的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白重组酶，基因序列见 genebank J01347. 1 ；
(3)将pDK6-red质粒电击转化入克雷伯氏肺炎杆菌细胞中；
(4)制备用于基因重组的DNA片段，该片段的两端含有与目的重组序列两端同源的同源臂，同源臂内侧连接抗性标记基因，抗性标记基因两端添加FRT序列；
其中，抗性标记基因，包括安普霉素、链霉素、四环素或氯霉素抗性基因；
FRT 序列为 gaagttcctatactttcta gagaataggaacttc (如 SEQ ID NO. 1 所示)；
(5)制备含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞，培养过程中在培养基中加入IPTG，诱导Red重组酶的表达；
(6)将用于基因重组的DNA片段，通过电击转化进入制备好的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞；
(7)将转化后的感受态细胞进行培养，通过所述的抗性标记，筛选重组菌株；
(8)通过抗性筛选获得的重组菌株进行传代培养，利用卡那霉素抗性平板筛选 pDK6-red质粒丢失菌株；
(9)pDK6-red质粒丢失菌株中，电击转入pDK6_fIp质粒，传代培养，利用步骤4)所述的抗性标记，挑选抗性标记基因消除的菌株；
(10)所述抗性标记基因消除的菌株，还能通过传代培养，利用卡那霉素抗性平板， 筛选pDK6-flp质粒丢失菌株；另外，所述pDK6-flp质粒丢失菌株，还能作为出发菌株，再次进行基因同源重组操作。
上述步骤(9)中，挑选抗性标记基因消除的菌株，除了单个抗性基因菌株外，还包括通过多个位点的基因重组获得的具有多个抗性标记基因的重组菌株，能通过pDK6-flp 质粒，将多个抗性标记基因同时消除。
综上所述，本发明的克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，可包括步骤
1)克隆Red重组酶基因，连接于pDK6质粒的多克隆位点，命名为pDK6-red质粒；
2)克隆Flp重组酶基因，连接于pDK6质粒的多克隆位点，命名为pDK6_flp质粒；
3)将pDK6-red质粒电击转化需要进行基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞；
4)制备含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞，培养过程中在培养基中加入IPTG，诱导Red重组酶的表达；
5)制备用于基因重组的DNA片段，该片段的两端含有与目的重组序列两端同源的同源臂；抗性筛选重组子时，同源臂内侧连接抗性标记基因；需重组后将抗性标记消除时， 抗性标记基因两端添加FRT序列；
6)将用于基因重组的DNA片段通过电击转化制备好的感受态细胞；
7)将转化后的感受态细胞进行培养，筛选重组子；
8)重组子可以重新按照步骤4-7)进行操作，选用不同抗性标记的DNA片段进行再一次的基因重组操作；
9)通过抗性筛选获得的重组子，或多次重组操作获得的具有多重抗性标记的重组子进行传代培养，利用卡那霉素抗性平板筛选pDK6-red质粒丢失菌株；
10)丢失pDK6-red质粒的重组子中转入pDK6_f Ip质粒，传代培养，利用抗性平板挑选染色体上相应的抗性基因消失的菌株；该菌株作为出发菌株可再次按照步骤3-8)操作，可以再次进行基因重组操作。
上述用于基因重组的DNA片段同源臂的长度在300-2000碱基对范围，其中，较优的长度为400-700碱基对。
上述用于抗性筛选的抗性标记基因，包括安普霉素、链霉素(壮观霉素)、四环素和氯霉素抗性等抗性基因。
本发明通过在克雷伯氏肺炎杆菌中，利用高拷贝表达质粒pDK6表达源于λ噬菌体的Red重组酶，利用Red重组酶催化进入克雷伯氏肺炎杆菌细胞的线性DNA片段与染色体DNA进行基因重组，重组子通过抗性标记或其它性状进行筛选；在用于同源重组的线性 DNA片段抗性标记基因两端连接FRT序列，使得外源DNA与染色体DNA发生同源重组后染色体上的抗性基因两端连接有FRT序列，利用含有Flp重组酶基因的pDK6-frp质粒在克雷伯氏肺炎杆菌中表达Flp重组酶，Flp重组酶对克雷伯氏肺炎杆菌染色体上的抗性标记进行消除，抗性消除菌株可以重新作为出发菌株进行基因重组操作，从而实现对一株克雷伯氏肺炎杆菌进行多次基因重组操作。
因此，通过本发明的方法，可实现在克雷伯氏肺炎杆菌染色体上进行一个或多个位点的基因重组操作，可实现基因敲除、基因插入、基因替换和定点突变等，具有更加广泛的在克雷伯氏肺炎杆菌中进行分子操作的应用。

以下实施例中使用的核酸内切酶、连接酶、质粒pMD18-TSimple、PCR试剂以及DNA片段回收等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。另外，涉及的引物均由上海博尚生物技术有限公司合成。
本发明的克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，包括步骤
l)pDK6-red质粒的构建根据Genbank中λ red的基因序列(AY048746)，设计引物1和引物2，其序列分别为GGTACCTACTGTTTCTCCATACCCGTT (如SEQ ID NO. 2所示)， 和 AAGCTTGCGTCATCGCCATTGCTC(如 SEQ ID NO. 3 所示)，并以 pIJ790 质粒(含有 λ red 基因)[见 Gust, B. , et al. , PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(4) :p. 1541.]为模板扩增约21Λ的基因片段，回收目的DNA与pMD18-T simple质粒连接，得到质粒pMD18T-red。然后，用KpnI和HindIII限制性内切酶分别双酶切质粒pDK6和pMD18T-red，回收酶切后的片段，再用T4DNA连接酶将pDK6和red片段连接，得到所要的质粒pDK6-red。
2)pDK6_flp质粒构建根据酿酒酵母2u质粒携带的flp的基因序列设计引物3禾口引物4，其序列分另Ij为ATGCCACAATTTGGTATATTATG (如SEQ ID N0. 4所示)禾口 TTATATGCGTCTATTTATGTAGGATG(如 SEQ ID N0. 5 所示)，以 pCP20 质粒(含有 flp 基因) [JAL Gust, B. , et al., PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(4) :p. 1541.]为模板，扩增约1. 27kb的基因片段，回收目的DNA与pMD18-Tsimple质粒连接，得到质粒pMD18T_f lp。 然后，用BamHI和I^stI分别双酶切质粒pDK6和pMD18T_flp，回收酶切后的片段，再用T4DNA 连接酶将PDK6和flp片段连接，得到所要的质粒pDK6-flp。
3) pDK6-red质粒转入克雷伯氏肺炎杆菌菌株克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞制作，按照J.莎姆布鲁克著，黄培堂译《分子克隆实验指南》科学出版社2005，所述大肠杆菌电击转化感受态细胞制作方法制作，克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞最终浓度为0D6(1(140。取 pDK6-red质粒与克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞混合，电击转化(电转仪设定2. 5kV，200 Ω， 25yF，使用2mm电转杯，本发明中电击转化都采用本操作条件)，利用卡那霉素抗性筛选， 获得携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌菌株。
4)携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌菌株感受态细胞的制备与不携带 pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌菌株感受态制备相同，所不同的是，仅增加菌株培养1 个小时后，在培养基中添加终浓度为lmmol/L的IPTG操作。
5)制备含有与需要进行重组的染色体DNA序列两端序列同源的DNA片段，利用电击转化入携带pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞。
6)培养转化细胞，利用抗性或其他标记对转化细胞进行筛选，挑出重组子。
7)利用多重抗性标记在同一菌株中进行多次基因重组操作重组子再次制备感受态细胞，制备感受态菌株时在菌株培养1个小时后，在培养基中添加lmmol/L的IPTG。制备用于重组的线性DNA片段，其中含有与前一次基因重组不同的抗性标记基因。利用制备好的线性DNA片段再次转化入受体克雷伯氏肺炎杆菌细胞，通过所述标记挑出再次发生重组的重组子。同样选用其他抗性标记基因重复上述操作，获得同一菌株中具有多种标记的多次基因重组的重组子。
8)抗性标记的消除
a.在制备上述用于同源重组的线性DNA片段时，在抗性标记基因两侧添加FRT序列(如SEQ ID NO. 1所示)。
b.重组子中pDK6-red质粒的消除。将重组子菌株在LB培养基液体传代培养，稀释后培养挑取单菌落，利用逐个检出法挑选卡那霉素抗性消失的菌落。
c.重组子转入pDK6_flp质粒。上述pDK6-red质粒消失菌落制备感受态细胞，利用电击转化法转入pDK6-flp质粒，利用卡那霉素抗性筛选转化子。
d. Flp重组酶催化FRT序列重组。37 °C LB培养基液体培养上述转化子，flp基因表达Flp重组酶，催化FRT序列发生重组使得中间的抗性基因被消除，利用逐个检出法挑取相应抗性消失菌落。本步骤可以挑选多个抗性同时消除的菌落，实现多个抗性标记在一次操作中消除。
e.重组子中pDK6_f Ip质粒的消除。将上述抗性消除的重组子菌株进行LB培养基液体传代培养，稀释后培养挑取单菌落，利用逐个检出法挑选卡那霉素抗性消失的菌落。
9)抗性消除的菌株可以重新制备成感受态细胞，从而实现在一个出发菌株中再次进行基因重组操作。
下面再举更加详细的实施例来对本发明方法予以说明。
实施例1
利用同源重组在克雷伯氏肺炎杆菌(K.peneumoniae)CGMCC 1. 6366中敲除依赖于ATP的二羟基丙酮脱氢酶基因dhakl。CGMCC 1. 6366菌株为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，具有氨苄青霉素抗性。
DCGMCC 1.6366感受态细胞的制备。按照如上所述制备，即“按照J.莎姆布鲁克著，黄培堂译《分子克隆实验指南》科学出版社2005”进行制备。
2)pDK6-red质粒构建，按照如上所述“pDK6-red质粒的构建”进行构建。
3)pDK6-flp质粒构建，按照如上所述的“pDK6_flp质粒构建”进行构建。
4)pDK6_red 质粒转入 CGMCC 1. 6366 感受态细胞
取pDK6_red质粒2 μ L，与制备好的100 μ L CGMCC 1. 6366感受态细胞混合。电击转化后细胞加入Iml的LB液体培养基37°C摇床，150转/min培养2小时。转入添加有 50mg/ml卡那霉素的LB固体平板，37°C培养1天，挑选长出的菌落10个，提取质粒，通过电泳进行验证，10个菌落都正确。命名为CGMCC 1. 6366-pDK6-red。
5) CGMCC 1. 6366-pDK6_red感受态细胞的制备与CGMCC 1. 6366感受态细胞制备方法相同，仅在细胞培养1个小时后，在培养基中添加lmmol/L的IPTG。
6)用于进行染色体上dhakl基因重组的DNA片段制备。
本步操作将需要进行重组的DNA序列克隆到质粒上，质粒转化入大肠杆菌；设计引物，一端含有与克隆的DNA片段两侧距离500bp左右序列同源的38和40个碱基，一端含有抗性核两侧同源的序列；以含有安谱霉素抗性基因的PIJ773质粒[见Gust，B.，et al.， PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(4) :p. 1541.]为模板，利用 PCR 合成的含有 38 和40个碱基的两个短同源臂的DNA片段，其中含有安谱霉素抗性基因并且抗性基因两侧具9有FRT序列(如SEQ ID NO. 1所示)；将合成的DNA片段转化入携带目的基因质粒的大肠杆菌种，利用大肠杆菌中Red重组系统使得含有抗性基因的线性DNA片段与质粒上同源片段进行重组，获得发生了基因重组的质粒，质粒中原来克隆的DNA片段中间部分被安谱霉素抗性基因替换。利用发生重组的质粒为模板根据原来克隆DNA片段两端序列设计引物，通过PCR获得两端具有400-700bp同源臂的DNA片段，其中带有安谱霉素抗性基因和FRT序列。具体操作如下
a.扩增 dhakl 基因:
设计引物dhakl-sl 和 dhakl-al，序列分别为GAATTCCGGAGCACTGAATAATGAA AAAGC (如 SEQ ID NO. 6 所示)和 AATCGGATCCGCTGCAGTCCAGCAGCAGATCGGCGTTA (如 SEQ ID NO. 7所示)，以CGMCC1. 6366总DNA为模板，上述dhakl-sl和dhakl-al为引物，利用PCR 进行DNA扩增，扩增产物中回收2. 5K长度片段，连接于克隆质粒pMDIS-T simple，命名为 pMD18-dhakI 质粒。
b. pMD18-dhakI质粒热击转化到含有pIJ790质粒的大肠杆菌Dffia_pIJ790，获得含有pMD18-dhakI质粒和质粒pi J790质粒的大肠杆菌，命名为Dffia-pMD18_dhakI。pi J790 质粒含有Red重组酶，受阿拉伯糖诱导调控。制备感受态Dffia-pMD18-dhakI细胞，在LB液体培养基中，37°C进行菌体培养1个小时后，添加lOmmol/L的阿拉伯糖。
c.设计引物FRT-sl 和 FTR-al，序列分别为ATGTCTCAATTCTTTTTTAACCAGCGCGCCAG CCTCGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC (如 SEQ ID N0. 8 所示)和 GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGTTCGCCG TGGATGCCCATTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (如 SEQ ID N0. 9 所示)。引物 FRT_s 1 序列中的部分序列 ATGTCTCAATTCTTTTTTAACCAGCGCGCCAGCCTCGT 与 dhakl 基因距离上端 500bp 相应序列同源，引物 FTR-al 序列中的部分序列 GGCGATGGTGGAGGCGCCAGGTTCGCCGTGGATGCCCATT 与 dhakl 基因距离末端500bp相应序列同源。利用引物FRT-sl和FTR-al，以质粒pIJ773为模板，扩增出长约1. 5kb的DNA片段A。该片段两段分别具有与dhakl上游和下游部分序列同源的同源臂，中间包含了来源于Pl J773的安谱霉素抗性基因aac(3) IV，并且在aac(3) IV基因两侧具有FRT序列。
d.利用DNA片段A转化感受态Dffia-pMD18-dhakI细胞。利用电击转化方法转化， 选择安谱霉素抗性的菌株，安谱霉素用量为50mg/L。在pIJ790表达的Red重组酶的催化下，DNA片段A两侧的同源序列与质粒pMD18-dhakI上的dhakl同源部分发生重组，获得了 PMD18-A 质粒。
e.设计引物 dhakl_s2 和 dhakl_a2，序列分别为ACCACACCCTGCTCGACGAT (如 SEQ ID NO. 10 所示)和 GACATCAATACCCC GCTGGAG (如 SEQ ID NO. 11 所示)，利用引物 dhakl_s2 和dhakl-a2，以pMD18-A质粒为模板进行PCR扩增，获得2. 7kb的DNA片段B。DNA片段 B两端分别具有478bp和66;3bp的dhakl基因序列，该序列作为同源臂。DNA片段B中间具有安谱霉素抗性基因aac (3) IV，aac (3) IV基因两侧具有FRT序列，DNA片段B用于进行 CGMCC1. 6366染色体上dhakl基因重组的线性DNA片段。
7)线性DNA片段B电击转化CGMCC1. 6366-pDK6_red感受态细胞
取DNA片段B 2 μ L，与制备好的100 μ L CGMCC1. 6366-pDK6_red感受态细胞混合， 利用2mm电转杯进行电击转化操作。转化后细胞加入Iml的LB液体培养基37°C摇床，150 转/min培养2小时。转入添加有50mg/ml安谱霉素的LB固体平板，37°C培养1天，长出菌落。
8)重组菌的验证
设计验证引物Yanzheng773z，其序列为 GCAAATACGGCATCAGTTACC (如 SEQ ID NO. 12所示)，该序列对应安谱霉素抗性基因aac (3) IV中间的一段序列。利用引物dhakl-s2 和Yanzheng773z，以步骤7)中长出的菌株总DNA为模板，进行PCR扩增，产物DNA片段为 11Λ，而以出发菌株(CGMCC 1.6366)总DNA为模板，进行PCR后，无特异性条带，表明获得的重组菌正确，并将该重组菌命名为CGMCC 1. 6366-pDK6-red-dhakr。
通过以上过程获得的CGMCC 1.6366-pDK6-red_dhakr菌株，是克雷伯氏肺炎杆菌 CGMCC1. 6366中染色体上的依赖于ATP的二羟基丙酮激酶基因dhakl与制备的含有同源臂的线性DNA片段的发生同源重组，使得染色体上的dhakl基因部分序列被安谱霉素抗性基因替换，实现了菌株染色体上敲除dhakl基因。
本发明获得的CGMCC 1. 6366-pDK6-red-dhakF菌株，可以用于dhakl基因功能与相关调控关系的研究。
实施例2
利用同源重组在克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1. 6366中敲除依赖于ATP的二羟基丙酮脱氢酶基因dhakl和赖于磷酸烯醇式丙酮酸的二羟基丙酮脱氢酶基因dhakll。
1)利用实施例1构建的CGMCC 1. 6366-pDK6-red_dhakr菌株制备感受态细胞。同样在细胞培养1个小时后在培养基中添加lmmol/L的IPTG。
2)制备用于进行染色体上dhakll基因重组的DNA片段
本步操作利用PCR直接制备具有长同源臂的用于同源重组的DNA片段，该DNA片段含有链霉素抗性基因，并且抗性基因两侧具有FRT序列(如SEQ ID NO. 1所示)。具体操作如下
a.扩增 dhakll 基因
设计引物dhakll-s 和 dhakll-a，序列分另Ij 为GAATTCCGGAGCACTGAATAATGA AAAAGC (如 SEQ ID NO. 13 所示)和 TCTAGATTCGATCGCTTCCATGACCTT (如 SEQ ID NO. 14 所示)，以CGMCC 1. 6366染色体DNA为模板，上述dhakll-s和dhakll-a为引物，利用PCR扩增，扩增产物中回收I长度片段，连接于克隆质粒PMD18-T simple，命名为pMD18_dhakII质粒。
b. dhakll上游同源臂扩增
设计引物dhakll-a2，序列为CGTCAGGTCGACGGATCCCCGGAATACCAGTTTTTCGATCA GTACGGTAT (如SEQ ID N0. 15所示)，其中，5’末端添加的25个碱基为与质粒pIJ778 [见 Gust, B. , et al. , PCR—targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003. 100(4) :p. 1541.]抗性核上游序列同源。以pMD18-dhakII质粒为模板，以dhakll-s和dhakll_a2为引物进行PCR扩增，回收0. 5K长度DNA片段。
c. dhakll下游同源臂扩增
设计引物dhakll-s2 引物，序列为AACTTCGAAGCAGCTCCAGCCTACAGTTCGGCACCTTCT TTATTCGCGCCG(如SEQ ID N0. 16所示)，其中5，末端的25个碱基为与质粒pIJ778抗性核下游序列同源。以pMD18-dhakII质粒为模板，以dhakll_s2和dhakll_a为引物进行PCR 扩增，回收0. 5K长度DNA片段。
d.用于基因重组的DNA片段扩增
以上述获得的上游同源臂和下游同源臂为引物，以质粒PIJ778为模板，进行PCR 扩增，获得2. 5k长度DNA片段即为目的DNA片段，命名为DNA片段C。其中，含有上游49!3bp 的同源臂和下游568bp的同源臂，中间部分含有链霉素抗性基因aadA，并且在链霉素抗性基因aadA两侧具有FRT序列。
3)线性 DNA 片段 C 电击转化 CGMCC 1. 6366-pDK6-red_dhakI-感受态细胞
取DNA 片段 C 2 μ L，与制备好的 100 μ L CGMCC 1. 6366-pDK6-red_dhakr 感受态细胞(0D_40)混合，电击转化操作。转化后细胞加入Iml的LB液体培养基37°C摇床，150 转/min培养2小时。转入添加有50mg/ml硫酸链霉素的LB固体平板，37°C培养1天，待长出菌落。
4)重组菌的验证
设计引物Yanzheng778z，其序列为GCAAATACGGCATCAGTTACC (如 SEQ ID NO. 17 所示)，该序列为链霉素抗性基因aadA的同源序列。利用引物dhakll-s和Yanzheng778z，以步骤幻获得的菌株总DNA为模板，进行PCR扩增，获得1. 51Λ条带，表明获得的重组菌正确， 并将该重组菌命名为 CGMCC 1. 6366-pDK6-red-dhakrdhakir。
通过以上过程获得的CGMCC 1.6366-pDK6-red-dhakrdhakir菌株，是克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC 1. 6366中染色体上的依赖于ATP的二羟基丙酮激酶基因的dhakl和依赖于磷酸烯醇式丙酮酸的二羟基丙酮激酶基因的dhakll两个基因部分序列通过同源重组被安谱霉素抗性基因和链霉素抗性基因分别替换。
5)重组子安谱霉素和链霉素抗性的消除
首先，消除重组子携带的pDK6-red质粒，再转化进pDK6_fIp质粒，利用pDK6-flp 质粒表达的Flp重组酶对FRT序列进行消除，从而消除菌株携带的抗性基因。具体操作如下
a.重组子中pDK6-red质粒的消除
将重组子CGMCC 1. 6366-pDK6-red-dhakFdhakI Γ 菌株，在 42°C 进行 LB 培养基液体传代培养，稀释后培养挑取单菌落，利用逐个检出法，挑选卡那霉素抗性消失的菌落。
b.重组子转入pDK6_f Ip质粒
用上述步骤a)的抗性消失菌落制备感受态细胞，利用电击转化法转入pDK6-flp 质粒，利用卡那霉素抗性筛选转化子。
c. Flp重组酶的表达
37°C、LB培养基液体培养上述步骤b)的转化子，利用逐个检出法，挑取安谱霉素和链霉素抗性消失菌落。
d.重组子中pDK6_flp质粒的消除
将上述步骤c)的抗性消除的重组子菌株，在42°C进行LB培养基液体传代培养，稀释后培养挑取单菌落，利用逐个检出法，挑选卡那霉素抗性消失的菌落。命名为 CGMCC1. 6366-dhakFdhakIF 菌株。
通过以上过程获得的CGMCC 1.6366-dhakrdhakir菌株，是克雷伯氏肺炎杆菌CGMCC1. 6366中dhakl和dhakll基因通过同源重组被敲除部分序列从而丧失功能的菌株， 菌株不带有外加的抗性基因。
本发明获得的CGMCC 1. 6366_dhakrdhakir菌株，可用于dhakl和dhakll功能以及在操纵子中的调控关系的研究。


本发明公开了一种克雷伯氏肺炎杆菌的基因重组方法，包括1)构建pDK6-red质粒；2)pDK6-red质粒转化入克雷伯氏肺炎杆菌细胞；3)制备用于基因重组的DNA片段；4)制备含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞，培养过程中加入IPTG；5)将用于基因重组的DNA片段，通过电击转化进入制备好的感受态细胞；6)培养转化后的感受态细胞，通过抗性标记筛选重组菌株；本发明采用不同的抗性标记基因，获得多位点重组菌株；同时，还能对抗性标记进行消除，抗性消除菌株可重新作为出发菌株进行基因重组操作，从而实现对一株克雷伯氏肺炎杆菌进行多次基因重组操作，因此，能具有更广泛的应用。