专利名称：去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白a、纯化方法及用途的制作方法图1为来源于肺炎不同菌株的16个氨基酸，去取代野生型肺炎表面蛋白(RX-1亚型)序列中与人心肌肌球蛋白具有高度同源性的16个氨基酸，形成的新的肺炎表面蛋白 (RX-1亚型)的突变株。而后将突变株及野生型自身序列，经I^irCOil2类似软件分析，其 16个氨基酸所形成α -螺旋结构的可能性，对于形成的结构进行比对，其分析图谱。Α:野生型肺炎表面蛋白PspA-RX-I，B 肺炎表面蛋白PspA-RX-l_BG9739 (SEQ ID No. 1)，C 肺炎表面蛋白 PspA-RX-l-BG3^6 (SEQ ID No. 2)，D 肺炎表面蛋白 PspA-RX-1-self。图 2为肺炎表面蛋白 A(PspA-RX-I， PspA-RX-l-BG9739(Mutantl)， PspA-RX-l-BG3296 (Mutant2))纯化的 SDS-PAGE 电泳图。从右向左1为标准蛋白分子量；2为I3SpA-RX-I ；3为 ^ρΑ-ΚΧ-1_Β69739 ；4为 PspA-RX-l-BG3296图 3 为小鼠免疫肺炎表面蛋白 PspA-RX-I，PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3^6 而产生的抗体水平。图 4 为免疫肺炎表面蛋白 PspA-RX-I，PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3^6 的小鼠，经肺炎链球菌毒攻试验的保护率。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
①，通过序列同源性软件分析确定了 PspA-RX-I亚型蛋白中16个氨基酸序列与人心肌肌球蛋白一段序列具有高度同源性，这样若使用I^pA-RX-I作为免疫性抗原的话，存在免疫安全隐患。这16个氨基酸序列为EAKAKLEEAEKKATEA
②，采用Paircoil2类似软件分析这16个氨基酸序列的结构，并从其他亚型的 I^spA分子中挑选出不同的16个氨基酸片段对野生型的PspA-RX-I的16个氨基酸序列进行替换，形成新的 PspA-RX-I 序列，即 PspA-RX-l-BG9739，PspA-RX-l-BG3296,再通过分子二级结构的模拟，将模拟的结构与野生型PspA-RX-I的结构对比预测，我们选择了相对于野生型I3SpA-RX-I结构变化最小的两个I3SpA-RX-I的突变株Ι^ρΑ-ΚΧ-1-Β69739， PspA-RX-l-BG3296
③，PspA-RX-I野生型序列中的16个氨基酸EAKAKLEEAEKKATEA，分别被 EAEKKVTEARQKLDAE (来源于肺炎链球菌BG9739)和EAI^QNKLAAKKAELAKK (来源于肺炎链球菌 BG3296)取代。
得到去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A，分别用序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列或用序列表SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
实施例2
表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的基因，是所述表达序列表SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 3所示；所述表达序列表SEQ ID No. 2 所示的氨基酸序列的基因用序列表SEQ ID No. 4所示。
SEQ ID No. 3 所示基因是 PspA-RX_l_BG9739 基因用 DNA2. 0 优化了的 DNA 序列；
SEQ ID No. 4 所示基因是 PspA_RX-l_BG3^6 基因用 DNA2. 0 优化了的 DNA 序列。
实施例3
含有表达去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体，将序列表SEQ ID No. 3所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体1 ；或将序列表SEQ ID No. 4所示基因插入到表达载体PET9a中得到重组载体2。
实施例4
含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株，将所述重组载体1导入到大肠杆菌E. Coli BL21中或将所述重组载体2导入到大肠杆菌E. Coli BL21中得到含有去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株。
在BL21大肠杆菌中重组表达。在加入IPTG后，目的蛋白表达在细胞质中。
实施例5
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法(SEQ ID No. 1，SEQ ID No. 2 都是分别采用本实施例的方法纯化)，包括如下步骤
(1)发酵实施例4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以4倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以4倍样品体积的含400毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以4倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以3-5倍柱体积的含有100毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用4倍柱体积的含有250毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以PH = 4.0的20毫摩尔/升柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以4倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以4倍柱体积的含有300毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用4倍柱体积的含有500毫摩尔/升氯化钠的pH =4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。(图2)。
实施例6 将 PspA-RX-1，PspA-RX+BG9739 (SEQ ID No. 1)禾口 PspA-RX-l-BG3296 (SEQ ID No. 2)各50ug，对小鼠进行免疫。0，14天各免疫两次。用磷酸铝佐剂最为阴性对照。在28天采血进行抗体测量，并用500CFU的肺炎链球菌进行静脉注射。监测小鼠的存活能力。其抗体水平图3。该数据显示，用PspA-RX-l-BG9739和 PspA-RX-l-BG3296进行免疫，可以产生Anti-RX-I的抗体，其水平在统计上不低于用野生型RX-I抗原进行免疫的水平。
小鼠存活的天数为图4所示。显示出Mutantl和Mutant 2具有和RX-1野生型蛋白相同的保护力。而磷酸铝佐剂不具有保护力。
我们在I^pA-RX-I亚型蛋白中发现了一个16个氨基酸长度的多肽片段。其序列为EAKAKLEEAEKKATEA。该序列和人的心肌肌球蛋白的序列有高度相似。
本发明针对野生型PspA-RX-I抗原决定簇与人体心肌肌球蛋白的具有高度同源性的16个氨基酸在保证结构变化影响最小的情况下进行氨基酸替换。新生产的两个分子具有不弱于野生型I3SpA-RX-I的抗原性和保护性，而降低了 PspA-RX-I和人蛋白的同源性。 使其安全的应用于疫苗的开发。
我们从其他亚型的I^spA分子中挑选出不同的16个氨基酸片段进行分子二级结构的模拟(采用Paircoil2类似软件，图1)。对比预测的结果，我们选择了结构变化最小的两个PspA-RXl的突变株。其中PspA野生型序列中的16个氨基酸EAKAKLEEAEKKATEA，分别被EAEKKVTEARQKLDAE (来源于肺炎链球菌BG9739)和EAI^QNKLAAKKAELAKK (来源于肺炎链球菌BG3^6)取代。
我们通过与UAB 大学合作，以 PspA-RX-1, PspA_RX-l_BG9739 (SEQ ID No. 1)和 PspA-RX-l-BG3296 (SEQ ID No. 2)进行动物免疫性试验，发现替换16个氨基酸以后形成的两个突变 PspA-RX-l-BG9739(SEQ ID No. 1)和 PspA-RX-l_BG3296 (SEQ ID No. 2)与野生型 PspA-RX-I具有相同的毒攻保护性
实施例7
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，包括如下步骤
(1)发酵实施例4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔 /升tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤⑵获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以3倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以3倍样品体积的含350毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以3倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以3倍柱体积的含有50毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3倍柱体积的含有160毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20 毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以3倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以3倍柱体积的含有250毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用3倍柱体积的含有450毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。
实施例8
去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A的纯化方法，包括如下步骤
(1)发酵实施例4制备的含有人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A基因重组载体的菌株；
(2)将所述菌株发酵液7200rpm离心15分钟，收集沉淀，用pH = 8. 0的20毫摩尔 /升tris重悬沉淀，勻浆细胞破碎，8000rpm离心30分钟，取上清液；
(3)批次吸附将Q sepharose fast flow与步骤(2)获得的上清液混合搅拌吸附2小时，缓冲体系为pH = 8. 0的20毫摩尔/升tris ；以5倍所述步骤(2)获得的上清液体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液将吸附产物洗脱，以5倍样品体积的含450毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液洗脱，得到Elute产物；
(4)将Elute产物用pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(5) Q柱准备以5倍的柱体积的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡Q柱；
(6)上样将步骤(4)得到的产物上样Q柱；
(7)以5倍柱体积的含有150毫摩尔氯化钠的pH = 5. 4的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用5倍柱体积的含有300毫摩尔/升氯化钠的pH = 5. 4 的20毫摩尔/升柠檬酸柠-檬酸钠缓冲液Elute洗脱；
(8)将步骤(7)获得的产物以pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液超滤脱盐处理；
(9) SP柱准备以5倍的柱体积的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液平衡SP柱；
(10)上样将步骤⑶获得的产物上样SP柱；
(11)以5倍柱体积的含有350毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液wash洗脱，再用5倍柱体积的含有550毫摩尔/升氯化钠的pH = 4. 0的20毫摩尔/升柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液Elute洗脱；得到纯度90%以上的去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白。


本发明公开了去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A、纯化方法及用途，所述去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A是序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或是序列表SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明的一种去除人同源性的肺炎链球菌表面蛋白A具有不弱于野生型肺炎链球菌表面蛋白A(RX-1亚型)的抗原性和保护性，而降低了肺炎链球菌表面蛋白A(RX-1亚型)和人体心肌肌球蛋白的同源性。使其安全的应用于疫苗的开发。