专利名称：一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型h1n1流感病毒药物中的应用的制作方法甲型Hmi流感病毒[Influenza A (HlNl) virus]是人类最常感染的流感病毒之一，易变异、传染性强、传播快、发病率和死亡率高。从19世纪以来已出现过数次全球性的大流行，最近一次即2009年爆发于墨西哥的Hmi疫潮。目前，抗甲型Hmi流感病毒的药物主要推荐磷酸奥司他韦，商品名达菲。达菲属于神经氨酸酶抑制剂，是通过抑制神经氨酸酶的活性，起到抑制病毒在人体内尤其是呼吸系统扩散的作用，从而阻断病毒感染循环过程。达菲能够减少通过打喷嚏散播出来的病毒， 但不能完全加以制止；此外，该类药物毒副作用强，易导致耐药毒株出现，限制了其临床应用。因此，寻找新的高效低毒的抗流感病毒药物依然任重道远。1-甲酯基-β -咔啉(l-carbomethoxy-β -carboline)属于 β -咔啉类衍生物， β-咔啉类化合物是一类广泛分布于自然界的生物碱，近年研究表明其具有抗肿瘤活性。 1-脱氧甘露糖野尻霉素(1-deoxymarmojirimycin)是一种由1_脱氧野尻霉素衍生而来的多羟基生物碱，1-脱氧野尻霉素及其衍生物作为糖苷酶抑制剂，具有降血糖、抗肝炎病毒、 抑制肿瘤转移等作用，且细胞毒性小。目前，两类化合物在医学领域的用途逐渐受到重视， 具有潜在的新药开发前景，然而尚未见应用于甲型Hmi流感病毒的相关报道。
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种生物碱类成分组合物在制备抗甲型Hmi流感病毒药物中的应用，可有效解决制备防治甲型Hmi流感病毒药物制剂，用于防治甲型Hmi流感的问题。本发明解决的技术方案是，由1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素混合在一起组成，二者的重量比是1-5 1-5，可有效用于制备治疗和预防甲型Hmi流感的药物，实现组合物在制备防治甲型Hmi流感药物中的应用。本发明组合物简单，原料丰富，易生产，有效用于制备治疗和预防甲型Hmi流感的药物，以满足防治甲型Hmi流感的用药问题，是防治甲型Hmi流感药物上的创新。作详细说明。实施例1本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为1 5，有效用于制备防治甲型Hmi流感的药物。实施例2本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为5 1，有效用于制备防治甲型Hmi流感的药物。实施例3
本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为2 4，有效用于制备防治甲型Hmi流感的药物。实施例4
本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为4 2，有效用于制备防治甲型Hmi流感的药物。实施例5
本发明在具体实施中，所述的1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素的重量比为3 3，有效用于制备防治甲型Hmi流感的药物。本发明所述的1-甲酯基-β-咔啉、1-脱氧甘露糖野尻霉素，可以利用多种常规提取分离手段从桑叶或鸭跖草等植物中获得，或者通过合成及半合成手段获得，也可商购获得。本发明组合物具有杀灭甲型Hmi流感病毒的显著作用，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下
ι.本发明生物碱类成分组合物体外抗甲型Hmi流感病毒实验 1.1实验材料
ι. ι. 1细胞狗肾传代细胞(MDCK)。1. 1. 2病毒株A/PR/8/34(HlNl)病毒株，由武汉大学医学院病毒研究所提供。1. 1. 3药物本发明药物，1-甲酯基-β -咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素均购自 Sigma公司，按重量比1:2混合。阳性对照药，磷酸奥司他韦胶囊(达菲)，购自上海罗氏制药有限公司，批号B1212。均以MEM细胞培养液配成溶液，经0. 22 μ m滤膜除菌后备用。1.2实验方法
1. 2. 1 MTT法测定药物的细胞毒性
单层MDCK细胞培养于96孔培养板，以MEM细胞培养液梯度稀释本发明药物，按每孔 0. Iml接种于培养板，每浓度重复8孔，同时设正常对照组和达菲阳性对照组。培养4 后， 倒置显微镜下观察细胞病变程度(CPE)，MTT染色，测定细胞存活量，Reed-Muench法计算半数中毒浓度(TD50)。1. 2. 2体外抗甲型Hmi流感病毒作用
单层MDCK细胞培养于96孔培养板，采用三种方式加药①药物后处理，先吸附0. Iml 病毒液(100TCID50)，2h后弃病毒上清，根据细胞毒性实验结果，在无毒浓度范围内，加入梯度稀释的药物0. Iml0②药物共处理，药物与病毒混合作用池后接种。③药物预处理，先加药物，池后弃去，再吸附病毒，最后换成药物。三种给药方式均设正常对照组、达菲阳性对照组及病毒对照组，每浓度重复8孔。继续培养，每日观察CPE，约在病毒对照组细胞CPE 达到4+时用MTT法染色，酶标仪测570nm处OD值。根据Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)，进而得到药物的治疗指数(Tl) =TD50/IC50。1.3实验结果1. 3. 1体外抗甲型Hmi流感病毒作用
研究表明，本发明药物对甲型Hmi流感病毒直接抑制作用不甚明显，有显著的预防和治疗作用，结果见表1。 表1.本发明药物不同给药方式抗甲型Hmi流感病毒作用
给药方式IC50(μ g/mL)TD50(μ g/mL)TI预处理120138011. 50共处理24013805. 75后处理110138012. 55
1.4结论
上述实验结果说明，本发明药物具有良好的抗流感病毒活性，对甲型Hmi流感病毒有显著的预防和治疗作用。2.本发明生物碱类成分组合物体内抗甲型Hmi流感病毒实验 2. 1实验材料
2. 1. 1病毒株A/PR/8/34(HlNl)病毒株，由武汉大学医学院病毒研究所提供。2. 1. 2药物本发明药物，1-甲酯基-β -咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素均购自 Sigma公司，按重量比1:2混合。阳性对照药，磷酸奥司他韦胶囊(达菲)，购自上海罗氏制药有限公司，批号B1212。2.1.3动物昆明种小鼠，雌性，体重OO 士 2) g，由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号SCXK (鄂)2003-0005。2.2实验方法
2. 2. 1对小鼠最大无毒浓度的测定
将本发明药物倍比稀释为6个剂量组，每组6只小鼠，另设一正常对照组给予等体积生理盐水，灌胃每天2次，连续2天，给药后观察5天，每天记录每组小鼠的中毒情况，进而确定小鼠的灌胃给药剂量。2. 2. 2对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
将小鼠随机分为6组，每组10只①病毒对照组；②给药低剂量组(12. 5mg/kg)；③给药中剂量组(25mg/kg)；④给药高剂量组(50mg/kg)；⑤阳性对照组(60mg/kg)；⑥正常对照组。采用致死剂量100ID50的流感病毒滴鼻感染小鼠(正常对照组以等量生理盐水滴鼻)，池后各组灌胃给药，病毒对照组和正常对照组给予等体积生理盐水，每天1次，连续7 天。给药后跟踪观察14天，每天观察并记录动物的反应、出现死亡的时间和死亡数。2.2.3对流感病毒感染小鼠肺部病变和病毒增殖的影响
将小鼠随机分为6组，每组10只①病毒对照组；②给药低剂量组(12. 5mg/kg)；③给药中剂量组(25mg/kg)；④给药高剂量组(50mg/kg)；⑤阳性对照组(60mg/kg)；⑥正常对照组。以15ID50流感病毒滴鼻感染小鼠(正常对照组以等量生理盐水滴鼻)，于感染前1 天开始灌胃给药，感染后继续给药，病毒对照组和正常对照组给予等体积生理盐水，每天1 次，连续7天。末次给药后各组动物称体重，取双侧肺称重，计算肺指数肺指数=肺重 /体重X 100 ；各组取部分肺组织，加入生理盐水研磨，制成肺悬液，3000rpm离心10分钟，取上清按有限稀释法测定病毒滴度；另取部分肺组织，置福尔马林中固定，石蜡包埋，作 5 μ m切片，常规HE染色，显微镜下观察肺组织病理结构变化。采用SPSS软件对结果进行统计分析。
2. 3实验结果
2. 3. 1对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
研究表明，本发明药物高、中剂量组可使流感病毒感染小鼠的死亡率明显降低，存活时间明显延长，与病毒对照组比较有显著差异，见表2。表2.本发明药物对流感病毒致小鼠死亡的保护作用


本发明涉及生物碱类成分组合物在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，可有效解决制备防治甲型H1N1流感病毒药物制剂，用于防治甲型H1N1流感的问题，其解决的技术方案是，由1-甲酯基-β-咔啉和1-脱氧甘露糖野尻霉素混合在一起组成，二者的重量比是1-5︰1-5，可有效用于制备治疗和预防甲型H1N1流感的药物，实现组合物在制备防治甲型H1N1流感药物中的应用，本发明组合物简单，原料丰富，易生产，有效用于制备治疗和预防甲型H1N1流感的药物，以满足防治甲型H1N1流感的用药问题，是防治甲型H1N1流感药物上的创新。