专利名称：天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料及其籽晶诱导制备方法骨组织工程材料是骨修复的关键材料，是骨修复医学发展所需要的重要基础。按 照骨组织工程支架材料设计原理，这种材料应该由可降解的高分子材料与钙一磷无机材料 制备的复合材料，其结构应该是多级网络结构。可降解的高分子材料主要为合成高分子材 料、天然高分子材料，其中合成高分子材料主要包括聚乙醇酸和聚乳酸及其复合物；天然 高分子材料主要包括胶原蛋白、明胶和壳聚糖等；钙一磷无机材料主要包括羟基磷灰石和 三磷酸钙等。理想的骨组织工程材料应该具有二级三维网络结构。其中一级结构是可降解聚合 物，其孔径大小在50 - 200微米，主要是为支架提供初始强度，并为细胞提供粘附、迁移、增 殖和分化以及组织构建的空间；二级结构为羟基磷灰石纳米网络结构，主要是提供钙源，并 且对以及网络提供有效补强作用，更重要的是提供通道供降解产物的排出。一般情况下，骨组织工程材料有两种制备方法，一种是将合成好的羟基磷灰石与 聚合物混合，制备成凝胶后，采用冷冻干燥的方法制备具有三维网络结构的复合支架材料。 这种方法复合的羟基磷灰石含量有限，如果含量太高则会降低支架的强度；另外一种方法 是，先将高分子材料制备成凝胶后，进行冷冻干燥，制备单一组分的高分子三维结构支架， 然后在支架表面采用化学沉积法涂覆一层羟基磷灰石。后一种方法由于可以获得足够的钙 源，并且表面的羟基磷灰石层可以对支架材料起到补强作用，而为人们广泛重视。但是，由 于纯的聚合物支架孔道表面均勻光滑，没有晶体成核所需要的位点，羟基磷灰石难以在上 面生长，无法在支架孔道表面得到羟基磷灰石层；经过长时间沉积，可能会生长一层致密的 羟基磷灰石，无法实现高分子降解产物的排出，更难以实现羟基磷灰石的重构，从为造成骨 修复带来困难。
针对现有技术中材料和制备方法的缺点，本发明提出了一种天然高分子一羟基磷 灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料及其籽晶诱导模拟生物矿化的方法。本发明所述天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料，由 天然高分子材料与纳米羟基磷灰石采用诱导模拟生物矿化的方法制得；其特征在于所述 支架材料由两级网络结构组成，一级结构为由天然高分子组成的三维网络结构，其壁厚为 1 - 3微米，孔道直径为50 - 150微米，二级结构为在一级结构孔道表面形成的由纳米羟 基磷灰石组成的三维网络结构，其壁厚为20 - 40纳米，孔道直径为100 - 120纳米；其中，所述天然高分子材料是壳聚糖或I型胶原蛋白，所述纳米羟基磷灰石是直径20士5纳米、长 度120士50纳米的羟基磷灰石纳米棒，所述天然高分子材料与纳米羟基磷灰石复合的重量 比例是4:1 - 2:1。其中，上述壳聚糖的脱乙酰度彡90%，粘度(1%溶液，20°C )彡100 mpa. s，pH值为 7. 0 - 8. 0。上述I型胶原蛋白的分子量为3000 - 20000道尔顿。本发明所述天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料的 制备方法，步骤是(1)配制浓度为2- 10wt%的可降解天然高分子材料溶液，然后按天然高分子材料与 纳米羟基磷灰石的重量比例为4:1 一 2:1的比例，将直径20士5纳米、长度120士50纳米的 羟基磷灰石纳米棒作为纳米籽晶分散在高分子材料溶液中，再按天然高分子材料与京尼平 的重量比例为100:1 — 300:1的比例，将交联剂京尼平加入含有羟基磷灰石纳米棒的溶液 中，形成溶胶；(2)将上述溶胶放入超低温冰箱中快速冷冻，并在一30°C 一 50°C温度下冷冻干燥， 得到含有羟基磷灰石纳米籽晶的高分子多孔支架材料；(3)将上述支架材料材料浸于模拟体液中，在37°C的恒温培养箱中矿化至在高分子多 孔支架材料孔道表面组装出一层具有纳米网络结构的羟基磷灰石，即得天然高分子一羟基 磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料；其中，所述模拟体液的组成以1升溶液计， 含Na+ (142 mM)、K+ (5 mM)、Mg2+ (1. 5 mM)、Ca2+ (2. 5 mM)、CF (120 mM)、HCO3- (27 mM )、HPO广(2. 27 mM)、SO广(0. 5 mM)、NaCl (8. 035 g)、NaHCO3 (0. 355 g)、KCl (0. 225 g)、 K2HPO4 · 3H20 (0. 231 g)、MgCl2 · 6H20 (0. 311 g)、1M HCl (38 ml)、CaCl2 · 2H20 (0. 3675 g)、NaSO4 · IOH2O (0.071 g), NH2C (CH2OH) 3 {Tris,^. 118 g)。其中上述方法中步骤(1)所述可降解天然高分子材料溶液的浓度优选为5 - 8wt%。步骤(1)所述天然高分子材料与纳米羟基磷灰石的重量比例优选为4:1 一 3:1 ； 其中，所述天然高分子材料是壳聚糖或I型胶原蛋白，所述纳米羟基磷灰石是常规水热法 制备的羟基磷灰石纳米棒。步骤(1)所述天然高分子材料与京尼平的重量比例优选为150:1 — 250:1。步骤( 所述冷冻干燥的温度优选是一 35°C 一 45°C，冷冻干燥的时间优选是 10 50小时。步骤(3)所述在37°C的恒温培养箱中矿化的时间优选是4 一 16天。本发明针对现有技术中存在的不足提出了籽晶诱导模拟生物矿化的方法，即在普 通的冷冻干燥制备三维高分子网络结构的基础上，在高分子多孔支架材料表面组装羟基磷 灰石纳米棒作为籽晶，在表面矿化的过程中，羟基磷灰石晶体在籽晶上面生长，形成羟基磷 灰石三维纳米网络，从而克服了高分子多孔支架表面无法形成羟基磷灰石的缺陷。采取这 种籽晶诱导生长方法可以成功地制备天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织 工程支架材料。利用上述方法获得的支架材料是天然高分子材料与纳米羟基磷灰石组成的 复合材料，由两级网络结构组成，一级结构为由天然高分子组成的三维网络结构，主要是为 支架提供初始强度，并为细胞提供粘附、迁移、增殖和分化以及组织构建的空间；二级结构5为在一级结构孔道表面形成的由纳米羟基磷灰石组成的三维网络结构，主要是提供钙源， 并且对形成的网络提供有效补强作用，更重要的是提供通道供降解产物的排出。综上，利用本发明方法得到的骨组织工程支架材料的突出优点是，其不但保留了 一级支架结构的孔隙率和孔道结构，而且在支架孔道表面获得足够的钙源，同时对支架有 补强作用，更重要的是，其三维孔道结构可以实现降解产物的排除，对骨组织的修复与重构 提供了重要的保证。这种具有二级三维网络结构的组织工程材料，不但具有更高的初始强 度，良好的可控的体内降解能力，特别有利于骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，并已经证 实具有良好的骨组织修复能力。由于所涉及的基质材料为天然高分子材料，交联剂为植物 提取物，籽晶为骨组织成分，所以，整个体系不但有很好的生物相容性，而且无毒且具备很 高的生物活性，预示这类材料将在修复医学中具有广泛的应用前景。


图1是本发明含有籽晶的壳聚糖多孔支架。图2是利用本发明方法制备的壳聚糖一羟基磷灰石二级三维网络结构的骨组织 工程支架材料及壳聚糖多孔支架孔道表面的羟基磷灰石三维纳米网络。图3是对比实验，不含籽晶的壳聚糖多孔支架。图4是对比实验，不含籽晶的壳聚糖多孔支架，经8天矿化后在壳聚糖多孔网络 结构孔道表面状态。

(1)准确称取1克的直径约20纳米，长度约120纳米的羟基磷灰石纳米棒作为纳米籽 晶，分散在100毫升浓度为的壳聚糖(壳聚糖的脱乙酰度> 90%,粘度(1%溶液，200C ) (100 mpa. s，pH值为7. 0)溶液中。将京尼平与壳聚糖的重量比例为1 :100的交联剂京尼 平加入含有羟基磷灰石的纳米棒的溶液中，搅拌形成溶胶。(2)将溶胶放入在一 80°C超低温冰箱中快速冷冻，并经一 30°C的条件冷冻干燥 36小时，得到一级孔直径为50微米含有羟基磷灰石纳米籽晶的高分子多孔支架材料(如图 1所示)；
(3)将上述支架材料放入400毫升模拟体液中，在37°C的恒温培养箱中，矿化4天，至 在高分子多孔支架材料孔道表面诱导出一层具有纳米网络结构的羟基磷灰石，即可以得到 一级孔直径为50微米羟基磷灰石二级网络厚度为200纳米的壳聚糖一羟基磷灰石二级三 维网络结构骨组织工程支架材料，纳米羟基磷灰石网络的壁厚为20 - 40纳米，孔道直径为 120纳米(附图2)。其中，所述模拟体液的组成以1升溶液计，含Na+ (142 mM)、K+ (5 mM)、Mg2+ (1. 5 mM)、Ca2+ (2.5 mM) ,CF (120 mM) ,HCO3- (27 mM )、HP0广(2. 27 mM)、SO广(0.5 mM), NaCl (8.035 g) ,NaHCO3 (0.355 g)、KC1 (0.225 g)、K2HPO4 ·3Η20 (0.231 g)、MgCl2 ·6Η20 (0.311 g)、IM HCl (38 ml)、CaCl2 ·2Η20 (0.3675 g)、NaSO4 · IOH2O (0.071 g) ,NH2C (CH2OH) 3 {Tris, 6. 118 g)。实施例2. —级孔直径为100微米羟基磷灰石二级网络厚度为400纳米的壳聚糖一羟 基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料的制备
同实施例1，将壳聚糖浓度改为3 wt% ；京尼平与壳聚糖的比例改为1:200 ；冷冻干燥 温度为一 40°C ；矿化时间改为10天；
可以得到一级孔直径为100微米羟基磷灰石二级网络厚度为400纳米的壳聚糖一羟基 磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料。
实施例3. —级孔直径为150微米羟基磷灰石二级网络厚度为800纳米的壳聚糖一羟 基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料的制备
同实施例1，将壳聚糖浓度改为2 wt%，京尼平与壳聚糖比例改为1:300 ；冷冻干燥温 度改为50°C ；矿化时间改为16天。可以得到一级孔直径为150微米羟基磷灰石二级网络厚度为800纳米的壳聚糖一 羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料。
实施例4. 一级孔直径为50微米羟基磷灰石二级网络厚度为200纳米的I型胶原蛋 白一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料的制备
同实施例1，将壳聚糖改为I型胶原蛋白(分子量为5000道尔顿)。可以得到一级孔直径为50微米羟基磷灰石二级网络厚度为200纳米的I型胶原 蛋白一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料。
实施例5. —级孔直径为100微米羟基磷灰石二级网络厚度为400纳米的I型胶原蛋 白一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料的制备
同实施例2.将壳聚糖改为I型胶原蛋白(分子量为10000道尔顿)。可以得到一级孔直径为100微米羟基磷灰石二级网络厚度为400纳米的I型胶原 蛋白一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料。
实施例6. —级孔直径为150微米羟基磷灰石二级网络厚度为800纳米的I型胶原蛋 白一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料的制备
同实施例3，将壳聚糖改为I型胶原蛋白(分子量为15000道尔顿)。可以得到一级孔直径为150微米羟基磷灰石二级网络厚度为800纳米的I型胶原 蛋白一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料。
实施例7.天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料制备 (1)配制浓度为5wt%的可降解天然高分子材料溶液(如壳聚糖溶液，其中壳聚糖的脱 乙酰度度彡90%，粘度(1%溶液，20°C )彡100 mpa. s, pH值为8. 0)，然后按天然高分子材 料与纳米羟基磷灰石的重量比例为3:1的比例，将直径20士 1纳米、长度120士 10纳米的 羟基磷灰石纳米棒(所述纳米羟基磷灰石是常规水热法制备的羟基磷灰石纳米棒)作为纳 米籽晶分散在高分子材料溶液中，再按天然高分子材料与京尼平的重量比例为200:1的比 例，将交联剂京尼平加入含有羟基磷灰石纳米棒的溶液中，形成溶胶；(2)将上述溶胶放入超低温冰箱中快速冷冻，并在一40°C温度下冷冻干燥，得到含有 羟基磷灰石纳米籽晶的高分子多孔支架材料；
(3)将上述支架材料材料浸于模拟体液中，在37°C的恒温培养箱中矿化8天，至在高 分子多孔支架材料孔道表面诱导出一层具有纳米网络结构的羟基磷灰石，即得天然高分 子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料；其中，所述模拟体液的组成以1 升溶液计，含Na+ (142 mM)、K+ (5 mM)、Mg2+ (1.5 mM)、Ca2+ (2.5 mM) ,CF (120 mM)、HC03-(27 mM )、HP0, (2. 27 mM)、S0广(0.5 mM) ,NaCl (8.035 g) ,NaHCO3 (0.355 g)、KC1 (0.225 g)、K2HPO4 ·3Η20 (0.231 g)、MgCl2 ·6Η20 (0.311 g)、lMHCl (38 ml)、CaCl2 ·2Η20 (0.3675 g)、NaSO4 · IOH2O (0.071 g), NH2C (CH2OH) 3 {Tris,^. 118 g)。
实施例8.水热法制备羟基磷灰石纳米棒
(1)分别准确称取10克Ca(NO3)2· 4H20和3. 35克(NH4) · 2HP04,分别溶解于70毫升 和80毫升的去离子水中，并用氨水将其pH值分别调节到11. 0和10. 0 ；
(2)将上述得到的硝酸钙溶液缓慢滴加到硝酸铵溶液里，最终形成钙/磷摩尔比为 1. 67的前躯体悬浮液(整个过程在剧烈地搅拌下进行)；
(3)将上述得到的前躯体转移到密闭的聚四氟乙烯的水热反应釜里，放入200°C的烘 箱里反应20小时；
(4)将上述得到的产物去离子水洗2遍，再用酒精洗1遍，最终抽滤干燥得到羟基磷 灰石纳米棒。
对比实施例
同实施例2，所不同的是不添加羟基磷灰石纳米棒。合成的壳聚糖多孔支架表面光滑(如图3所示)，经8天矿化后在壳聚糖多孔网络 结构孔道表面只有少许的羟基磷灰石突起，没有形成纳米羟基磷灰石网络结构。(如图4所 示)


本发明公开了一种天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料及其制备方法，是将羟基磷灰石纳米棒与天然高分子混合利用无毒交联剂京尼平进行交联，以冷冻干燥制备带有纳米籽晶的天然高分子多孔支架，再利用模拟体液进行生物矿化，在籽晶诱导下在具有微米级三维网络结构的天然高分子支架孔道壁上形成一层羟基磷灰石纳米三维网络结构。本发明的天然高分子一羟基磷灰石二级三维网络结构骨组织工程支架材料不但有很好的生物相容性，而且无毒且具备很高的生物活性，预示这类材料将在修复医学中具有广泛的应用前景。