专利名称：含有羟基磷灰石成分的多孔型骨修复体及其制备方法 骨修复是材料科学与生命科学的一个新的交叉领域，为骨缺损和骨肿瘤、及难治性骨折修复提供了一种极有前景的新方法，其中多孔修复体是骨修复工程的关键技术之一。多孔修复体的目的是为构建组织的细胞提供一个三维支架，为细胞生长提供合适的环境。多孔材料是细胞附着的基本框架和代谢场所，为新生组织提供支架，并保持一定时间直至新生组织具有自身生物力学特性。多孔材料在骨修复工程中不仅起支撑作用，保持原有组织的形状，而且还起到模板作用，为细胞提供赖以寄宿、生长、分化和增殖的场所，从而引导受损组织的再生。钙-磷材料由于是构成人体硬组织无机质的主要成分，与人体组织有天然的亲和性，能和人体软、硬组织形成牢固的生物键合。由于自然骨的无机质主要是由纳米羟基磷灰石构成，纳米羟基磷灰石在自然骨中约占重量的65％左右，因此用纳米羟基磷灰石作为骨替代物的原理和优点是不言而喻的。进一步的研究表明，皮质骨主要由骨单位或称哈佛氏系统组成，这些骨单位被一种硬组织基质或间质团聚在一起。目前已了解，骨单位间的物质交换是经过由横穿过骨间隙的福克曼氏管进行的，它使血液能流到最深的骨单位处，以保持骨的生理活性。要设计一种具有骨传导性的种植体，逻辑上它应类似基质或间质骨。由于骨单位直径约在190～230微米，并且是通过福克曼氏管进行物质交换，所以理想的骨移植替代物应是模拟皮质骨有相互贯通、直径很小的孔道系统。目前所用的羟基磷灰石陶瓷等钙-磷生物活性陶瓷替代材料，曾以块状和颗粒形式在临床广泛地用于肌肉-骨骼系统修复和重建。由于它与人体硬组织(如骨和牙等)的无机质具有相似的组分组成，因而具有良好的生物相容性和生物活性，但其块状陶瓷脆性大、加工难、易断裂；颗粒陶瓷又有游走、移位的缺点，且这些磷酸钙生物活性材料的力学性能并不令人满意，抗折强度和断裂韧性指标均低于人致密骨，而弹性模量却大大高于自然骨，因而在临床上限制了其在临床上的应用。聚酰胺由于和人体的胶原蛋白在分子结构上十分相似，所以和人体组织有良好的相容性，也是一类优良的医用高分子材料，并且具有较高的韧性和强度，在临床有广泛而长期的应用。自然骨是由羟基磷灰石和高分子胶原纤维构成的无机/有机复合材料，具有良好的力学性能。如何按自然骨的组成结构，制备与之类似的材料和微细结构的骨修复材料，使之具有良好骨传导和骨诱导性能，在理论和临床实践上都有十分重要的意义。为了提高钙-磷材料的柔韧性和可加工性，模仿天然骨的组成结构特点，制备具有生物活性和力学性能良好的无机/有机复合生物材料作为硬组织的骨修复、替代材料和组织工程骨修复体材料的主体，日益受到广泛重视。
根据上述情况，本申请首先是提供一种将韧性好和较接近人骨弹性模量的聚酰胺有机材料，与具有生物活性的无机材料复合，以模拟天然骨组成成分构建一种优良的多孔型骨修复体材料。该材料可加工成三维立体多孔结构，除满足生物相容性要求以外，还能支持新生细胞及组织在基质中粘附和适度生长，并诱导细胞正常形态和功能的表达，通过其所具有的合适机械强度以支撑组织或传递应力，使细胞能按照预先设计在三维形状支架上生长。在此基础上，本发明进一步将提供制备所说的该多孔型骨修复体的制备方法。
目前的研究结果表明，由于羟基磷灰石(HA)材料的生物活性好，能与骨组织形成牢固的键合；高分子材料的医用聚酰胺类成分(PA)则具有较高的韧性和强度，其主链上含有许多重复的极性基团，和极性无机材料相容性好，可以用来提高羟基磷灰石的韧性。实验结果同时还显示，HA在复合材料的含量越高，复合材料的生物活性就越好。将羟基磷灰石与聚酰胺复合后，能使二者的优良性能充分结合，从而可得到生物相容性和生物活性的骨修复和重建骨修复体材料。
据此，本发明的多孔型骨修复体，是由重量比为1/(1～0.3)的羟基磷灰石/医用聚酰胺类成分组成，骨修复体中还具有孔径为1-300微米的相互贯通的孔隙，孔隙的总体积占骨修复体材料总体积的30％-70％。
在本发明上述的骨修复体中，所说的孔隙最好是能同时包括有不同大小孔径形式的孔隙结构。例如，最好是同时包括有孔径为1-50微米的微孔和孔径为100-300微米的大孔；并且，微孔主要是存在于大孔的孔壁壁上。
由于在人自然骨中的羟基磷灰石含量相当的65％～70％，因此在本发明上述骨修复体组成中，羟基磷灰石成分的含量，也以采用为65％～70％的比例最佳，以实现能最大限度地提高多孔复合材料生物活性的目的和效果，成为一种更为理想的骨修复体材料。
在上述的骨修复体材料的组成中，所说的医用聚酰胺类成分，可以在目前已有使用的如聚酰胺6、聚酰胺66、聚酰胺11、聚酰胺12或聚酰胺MXD-6等类型的材料中选择。其中，优选的是聚酰胺66。不同的聚酰胺成分在性能特点及相应的用途范围等方面有一定的差异，例如，聚酰胺(PA)6与聚酰胺(PA)66相比，PA6的强度和弹性模量比PA66低一些，吸水性比PA66大一些，但与羟基磷灰石复合后得到的HA/PA6复合材料在体内降解速度比HA/PA66快，在一些要求降解速度较快的骨组织修复和组织工程方面较PA66优越一些，如骨缺损充填修复。另外，PA6的断裂伸长率和冲击强度(韧性)比PA66优良，加工流动性也好一些。而PA66则耐热性好，强度和硬度高，成型速度快，吸水率低。HA/PA66复合材料在体内降解低，在一些要求不降解的骨修复方面较PA6优越一些，如脊椎，颅骨等。PA11和PA12两类材料具有吸水率低，吸水后的物性和制品尺寸变化小；密度小，质轻；耐冲击性能良好；耐桡曲疲劳性优良，耐药品性能优良；耐磨性能好，柔软性能好等方面的优点，因而更适合于做小关节，义眼台(人工假眼球)，颌骨等地的修复体。聚酰胺MXD-6是由间苯二甲胺和1，6-己二酸经过压缩聚合制得的，与PA6和PA66相比，如拉伸强度、弯曲强度及弹性模量、硬度等性能都高，耐疲劳性优良，耐磨性好，对氧气、湿气阻隔性能优良，可以和多种热塑性高分子共挤出成型或共注射成型，加工性能好，适合于做各种关节，人工椎板、椎体等承重力位置的修复体。因此，在本发明的上述多孔型骨修复体材料中，对所说的医用聚酰胺类成分，可以根据具体的使用要求进行选择。
本发明上述多孔骨修复体的制备，可以采用将医用聚酰胺类成分的细粉与羟基磷灰石的细粉按所说的比例混合后，以固/液比为1克/(0.5～1)毫升的比例，与含有重量/体积比为14％-70％氯化钙的乙醇溶液混合后固化，并用水充分溶解除去固化材料中的水溶性成分，从而在固化体中形成多孔隙的结构。
在上述的制备方法中，所说的羟基磷灰石成分，可以采用目前已有报导的方法制备得到。例如，其中优选的为采用由钙盐和磷酸盐反应后，可以得到纳米级的羟基磷灰石粉末。其中，特别是使羟基磷灰石成分中的钙/磷摩尔比采用为的比例为理想。
所说的医用聚酰胺类成分细粉，可以由市购得到，也可以采用目前已有报导的方法制备得到。对于后者，可以作为参考的一种制备方法是将根据使用需要选定的聚酰胺类成分溶解于含有氯化钙的二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺溶液中，再将混合溶液倾入水中形成细粉，并将所得到的细粉离心清洗和烘干而成。其中，所说的含有氯化钙的二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺溶液中的氯化钙的重量/体积含量可以为18％～20％，聚酰胺类成分与溶液中二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺的重量/体积比为1/(15～40)。
在上述多孔骨修复体的制备方法中，一种可供实施时参考的具体方式，是将所说混合后的羟基磷灰石成分和聚酰胺类成分的细粉，与氯化钙/乙醇溶液混合后，先在空气中使其固化，使复合材料体随乙醇的挥发而固化，金属盐继续留存于固化物中。然后再将其放于水中，使其中水溶性的氯化钙成分进一步被溶解除去。在空气中的固化过程中，随着乙醇的挥发，在复合材料体中即可留下许多微孔，但氯化钙等金属成分仍留在复合材料中；置于水中后，则随着氯化钙成分从材料中进一步被溶解浸出，就可以在复合材料体中留下了许多新的微孔和/或进一步形成大孔。
另一种可供实施时参考的具体方式，是将所说混合后的羟基磷灰石成分和聚酰胺类成分的细粉，与氯化钙/乙醇溶液混合后，即置于水中，使复合材料的固化和将材料中的乙醇及氯化钙成分从复合材料中被溶解浸出的过程同时进行，从而在复合材料中留下大小孔隙。
经上述水溶解处理后的复合材料固化体取出后，一般可通过先在室温空气中阴干后，再于50℃-70℃烘干，即成为本发明所说的具有生物相容性和骨传导性能好，可作为替代和修复骨组织缺损的多孔骨修复体。
实验结果显示，上述两种不同的固化和水处理方法，可对在多孔骨修复体中所形成的孔隙孔径的大小有一定的影响。先在空气中固化，所形成的微孔很小，通常为1-20微米；而直接在水中固化，则微孔的孔径可为1-50微米或更大。因此，为了获得较小的微孔(1-20微米)，可采用先在空气中固化较长时间的方式，让乙醇基本上完全挥发，然后再置于水中进一步溶解除去氯化钙，即可获得100微米以上的较大孔隙，并且可在大孔的孔壁上形成许多贯通性的微孔。为了获得更大的孔(100-300微米)，则可将固化体直接放在水中固化，让水同时溶解掉材料体中的氯化钙和乙醇，在修复体中形成多孔隙的结构。
由于骨修复体的功能是引导种植的细胞或迁移到支架周围的细胞生长或增殖，因此其首先应该是能使细胞粘附、分化、增殖或迁移的支持底物，并易于被加工成三维的多孔结构。修复体的多孔性是非常重要的，适当的孔径和/或孔隙率有利于成骨细胞生长，因为它能使细胞迁移或增殖。孔径大小影响细胞的长入和支架的内表面积。具有较大内表面积的支架可培养更多的细胞，为再生器官提供足够数量的细胞。
本发明上述骨修复体中的多孔性结构正可以为细胞提供较大的粘附面，有利于细胞的粘附，并且允许血管组织向内生长。高孔隙率的材料具有大的比表面积，能够提供大量的细胞生长及分泌细胞外基质的足够空间，可提供给细胞生长所必须的气体和养分交换环境，有助于细胞的营养交换和废物排出。孔径大小已被证明是影响纤维血管组织内生的重要参数。孔径大小对于新生骨组织长入载体有着重要影响。研究表明，孔径尺寸为15-40微米，允许纤维组织长入；更小的微孔则可允许体液、组织液进入，形成全身液体循环，营养物质和氧气进入、代谢产物的排出；孔径为40-100微米，可允许非矿物类骨组织长入；孔径大于100微米，允许血管组织长入。为保持组织的生存能力和健康，孔径必须大于100-200微米，大孔径不仅能增加接触面积，增加抗移动能力，而且可为长入生物植入材料的联接组织提供血液供应。大孔壁上富含微孔的多孔材料，可吸附细胞因子、生长因子、蛋白质等有利组织生长的诱导因子。而采用传统工艺制备的多孔性支架材料和结构，则很难保证孔隙之间的完全贯通。
通过阿基米德方法测定的结果还显示，在上述的制备方法中，制备过程中所用原料和/或试剂中的氯化钙成分和/或乙醇的量，也与在所制得的多孔骨修复体中的孔隙孔径和孔隙率相关。氯化钙成分和/或乙醇的总量少，则可明显减少所成多孔骨修复体中的孔隙率。因此，通过改变制备过程中所用的氯化钙/乙醇溶液中的氯化钙浓度，和/或羟基磷灰石/聚酰胺类成分复合材料粉末与氯化钙/乙醇溶液混合时所用的固/液比例，可以实现将所制备的多孔骨修复体中的孔隙孔径和/或孔隙率，调节控制在所希望或需要的范围内。
由于占自然骨重量65％左右的羟基磷灰石成分主要是纳米羟基磷灰石，因此，为使本发明上述的羟基磷灰石成分和聚酰胺类成分的细粉能有更好的均匀混合程度，一个优选的措施，是在上述的制备过程中，作为重要原料的羟基磷灰石成分最佳的是采用为纳米级的羟基磷灰石。
实验结果显示，在本发明上述骨修复体的组成中，羟基磷灰石，特别是纳米羟基磷灰石/聚酰胺类成分在所说的1/(1～0.3)重量比的范围内，随着(纳米)羟基磷灰石成分所占比例的增加，所得到的复合材料不仅生物活性相应提高，抗压强度也随之相应增大。因此在制备时，通过改变(纳米)羟基磷灰石与聚酰胺类成分的组成比例，可以达到改善和提高多孔骨修复体在生物活性、力学特性等多方面的性能效果，以满足不同临床需要而进行综合调整的目的。
进一步的实验结果还证实，在本发明上述形式多孔骨修复体的固化过程中，氯化钙/乙醇的混合固化液是一个必要的条件。单独的乙醇或单独的氯化钙水溶液与羟基磷灰石/聚酰胺类成分的复合材料粉末混合后，该复合材料不会固化。复合材料的细粉只有在与氯化钙/乙醇混合固化液混合后，才能形成固化形态的材料体。
近年来关于多孔生物材料的研究，很大部分集中在多孔植入体孔结构，尤其是孔尺寸与多孔体与组织之间相互关系的影响。并逐步实现对多孔体孔径的控制，从而可根据不同的植入需求，制备不同孔径的植入体，在满足生物性能前提下，尽可能地提高其机械强度。在本发明的骨修复体结构中，具有孔径为1～300微米左右、孔隙率为30％-70％，且相互贯通的孔隙结构，因而极有利于组织长入和营养物质运输，是细胞生长的良好载体。因此，本发明具有上述复杂微观结构形状的骨修复体，能够很好地实现在形成多孔细胞载体框架结构方面的多种需要，是一种非常有发展前景的骨修复材料。
根据上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出多种形式的修改、替换或变更。
以下结合由附图所示实施例的
，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。


图1是对本发明制备多孔复合骨修复体合成的纳米羟基磷灰石浆液的扫描电镜观察结果。
图2～图5是本发明不同形式的多孔复合骨修复体材料的扫描电镜照片。
图6是用本发明的多孔骨修复体进行犬下颌体骨缺损修复实验的结果。

(1)复合材料粉纳米羟基磷灰石的制备以硝酸钙和磷酸铵以钙/磷摩尔比为1.60～1.67的量投料，经下列反应得到羟基磷灰石(pH＝10～12)将得到的无定型羟基磷灰石浆液在70℃在加热4小时，得到了纳米羟基磷灰石浆液，通过扫描电镜观察，羟基磷灰石的颗粒在100nm范围内，是纳米级的羟基磷灰石，扫描电镜观察的结果如图1所示。该纳米羟基磷灰石浆液在120℃烘干，磨细，过200目筛，得到纳米羟基磷灰石的粉末，备用。
聚酰胺类成分细粉可以采用目前市售的商品聚酰胺66或其它相应的聚酰胺细粉，也可以按现有报导的方法制备得到。
复合材料细粉的制备将上述的纳米羟基磷灰石细粉和聚酰胺66等聚酰胺类细粉按重量1/(1～0.3)的比例混合，磨细，用蒸馏水清洗2次，再烘干，再磨细，过400目，备用。此复合材料细粉中的羟基磷灰石含量可为60％左右。
(2)混合液体用氯化钙与无水乙醇配制成氯化钙含量分别为14克/100ml，20克/100ml，30克/100ml，60克/100ml的浆液，密封在瓶中备用。
(3)多孔复合骨修复体制备
制备方法1将上述的复合材料细粉和氯化钙含量分别为14克/100ml和20克/100ml的混合液体，按固体细粉/混合液体的比例(S/L)为1/0.5和1/0.7的比例混合，在研钵里充分调和2-5分钟，即得到固化物材料。放在一定形状的模具中成形，室温下固化，1天后取出固化体，再放入水中浸泡1-2天取出，在烘箱中50℃-70℃烘干，即分别得到两种多孔材料。扫描电镜(SEM)结果如图2和图3所示。SEM照片反映了样品的微观结构，通过照片观察孔径。气孔率采用阿基米德分析法测定。
图2显示的是由以14克/100ml的氯化钙/乙醇浆液按S/L为1/0.5所得到样品的微孔形态，大多数微孔的孔径在1-10微米范围内，孔隙率只有30％左右。由图3是以20克/100ml的氯化钙/乙醇浆液按S/L为1/0.7所得到样品的微孔形态，其孔隙的孔径基本上在100微米以上，除这些较大的孔径外，还有孔径在1-10微米的微孔，孔隙率为40％左右。从SEM照片可以看到，该多孔材料孔的形态很不规则，但呈现一种均匀的分布状态，这种孔(宏观孔)是由氯化钙浸出固化体形成的，孔壁上存在大量丰富微孔是由乙醇挥发形成的(微观孔)，这些微孔的存在使宏观孔之间相互连通。
这些结果说明，氯化钙的含量影响固化体孔径的大小和孔隙率，随着氯化钙和乙醇含量的增加，固化体孔径的大小和孔隙率都相应增加。
制备方法2将上述的复合材料细粉和氯化钙含量分别为30克/100ml和60克/100ml的混合液体，按S/L为1/0.7和1/1的比例混合，在研钵里充分调和2-5分钟，即得到固化物材料。放在模具中成形，仅在室温下固化1小时后，固化物材料连同模具放入水中，浸泡2天，取出，在烘箱中50-70℃烘干，既得到两种多孔材料。电镜扫描结果如图4和图5所示。
图4中的孔隙形态，大孔径在100-200微米，微孔5-20微米左右，孔隙率为55％。由图5可知，大孔的孔径基本上在100-300微米，除了这些较大的孔径，还有孔径在5-20微米的微孔，孔隙率70％。从图4和图5可以看到，该多孔材料孔的形态很不规则，但呈现一种均匀的分布状态，这种孔(宏观孔)是由氯化钙浸出固化体形成的，孔壁上存在的微孔是由乙醇溶解于水形成的，这些微孔的存在使更加宏观孔之间相互连通。
上述结果同样说明，氯化钙的含量将影响固化体孔径的大小和孔隙率。图4是用氯化钙含量为30克/100ml的浆液，以S/L比为1/0.7进行固化的复合材料。图5是用氯化钙含量为60克/100ml浆液，以S/L比为1/1进行固化的复合材料。随着氯化钙和乙醇含量的增加，固化体孔径的大小和孔隙率相应也都增加。
以上述的多孔纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨修复体进行了下述的修复犬下颌体骨缺损的实验，以观察多孔纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨修复体植入犬下颌骨皮质缺损后的组织修复过程方法在9只健康雄性杂种犬下颌骨上设计两个15×10×5mm的箱状缺损，在其中一个植入由本发明上述方法2制备的多孔块状预制品羟基磷灰石/聚酰胺66(HA/PA66)骨修复体(孔径基本上为100-200微米，除了这些较大的孔径，还有孔径在5-20微米的微孔，孔隙率55％)制成的相应大小预制块。术后2，4，8，12，16周处死动物，切取组织标本，做组织学观察。
结果术区伤口愈合良好，未见明显的排斥反应和植入多孔材料的裸露，软组织覆盖良好。
2～8周植入多孔材料周围被逐渐增厚的纤维结缔组织包裹，12周时骨修复体-组织界面上出现膜性成骨迹象，16周时HA/PA66骨修复体被新生骨组织完全包绕与人工骨形成骨性结合。此时，包裹材料的组织间成骨现象明显，新生的骨组织封闭缺损处的下颌骨骨髓腔，并且长入材料的表面孔隙内，材料-骨组织之间无结缔组织间隔形成完整的骨性结合。材料本身形态结构未见明显的改变，其周边组织内未见巨噬细胞对材料颗粒的吞噬。对照缺损处的骨组织未见有活跃的改建，缺损的骨组织已被纤维结缔组织替代。结果如图6所示。图6是植入后16周，长入多孔材料内的骨组织钉突(‘←’所指)已基本成熟‘#’处为多孔修复体。
通过对所用HA/PA66骨修复体的生物学特性观察可见，实验所用的多孔骨修复体植入动物体内后未发现毒性和异物反应，伤口愈合正常，未出现伤口感染、材料暴露和组织坏死；骨修复体植入体内后组织间的出血在材料周围和表面孔内形成血凝块，以后毛细血管及增生的成纤维细胞长入材料的孔隙内，外围则由软组织将其包裹，包绕多孔骨修复体的结缔组织层内并未见严重的炎症反应，这些均表明纳米羟基磷灰石骨修复体材料有良好的生物相容性。机械应力和骨组织之间存在一个动态平衡，在一定的生理应力范围内骨组织所受的应力变化对骨的形成和改建有积极的意义。常规的HA材料质地脆，在外力作用下易碎，并且不易塑形，无法修复长段及大范围的骨质缺损，手术中切削成形困难，临床可操作性差，而HA/PA66材料具有与皮质骨相近的力学性能，处于大范围皮质骨缺损处的材料修复后可传导正常的生物力，有利于新骨的形成和改建，从而为缺损处的功能和形态的完全恢复奠定了基础。
在上述实验的16周时，植入材料处缺损基本上被新骨修复，说明该多孔骨修复材料作为一种屏障能机械性的阻止成纤维细胞等周围结缔组织向缺损处的快速生长，将其排斥在缺损区外，引导迁移速度较慢的成骨细胞向缺损区内迁移，形成新骨。此过程中HA/PA66骨修复材料的主要作用是三维结构的支架作用，有利于受植骨床的血管、成骨细胞的长入。实验中的HA/PA66骨修复材料植入缺损后，在修复的早期为纤维结缔组织包裹，而后在包裹的组织中开始膜性成骨的过程，最终形成成熟骨组织。在长入材料表面孔隙的组织中，观察到膜性成骨常常是从与材料交界的部位开始成骨，而并非是从血供较丰富的外周逐渐长入。这表明材料的表面生物学特性有利于新骨的形成。12周时，包裹材料的组织-骨界面上开始形成新骨，但新骨的钙化程度低。16周时，新骨的范围和钙化程度增加，骨痂密度增大，多孔修复体材料和周围的骨组织已完全融合在一起，两者间的分界已不很明显；钙化良好的骨组织包裹材料，两者间界面形成骨性结合。
结论本发明的多孔纳米羟基磷灰石/聚酰胺骨修复体，具有良好的生物相容性，修复组织为膜性成骨，16周时人工骨与骨组织形成骨性的结合，并且该材料还具有骨引导和可能具有潜在的骨诱导作用。


含有羟基磷灰石，特别是采用纳米羟基磷灰石复合材料的多孔型骨修复体及其制备方法。该多孔型骨修复体是由重量比为1/(1～0.3)的羟基磷灰石/聚酰胺类成分组成，并具有孔径为1－300微米的相互贯通的孔隙，总孔隙率为30－70％。制备时，先将按所说比例的羟基磷灰石细粉和聚酰胺类成分的细粉混合后，再与含有氯化钙的乙醇溶液混合后固化，并用水溶解除去固化材料中的水溶性成分而在骨修复体材料中形成孔隙结构。本发明的多孔型骨修复体具有好的生物相容性和生物活性而用于替代和修复骨组织缺损和组织工程中细胞培养的理想骨修复体材料。