专利名称：一种发酵制备2-kga的营养强化培养基及其制备2-kga的方法一种发酵制备2-KGA的营养强化培养基及其制备2-KGA的方法所属领域本发明涉及发酵工程与生物技术领域内的一种培养基，尤其是一种发酵制备 2-KGA的营养强化培养基，同时本发明还涉及一种应用该强化培养基制备2-KGA的方法。2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,简称 2-KGA)是制备维生素 C (L-抗 坏血酸)的重要前体。目前工业上主要采用“二步发酵法”工艺。该工艺需要经过两步发酵 过程第一步发酵，以D-山梨醇为底物，经醋酸菌Acetobacter sp.发酵，获得L-山梨糖， 第二步发酵，以L-山梨糖为底物，经生酮基古龙酸菌Ketogulonigenium vulgare (俗称小 菌)和芽孢杆菌Bacillussp (俗称大菌)两种微生物的混合发酵，获得2-KGA。第一步发酵 与第二步发酵联合起来形成了由山梨醇到2-KGA的“二步发酵法”工艺。“二步发酵法”工艺的主要特点是在“第二步发酵”过程中，由于芽孢杆菌Bacillus SP (俗称大菌)的伴生，普通生酮基古龙酸菌Ketogulonigeniumvulgare (俗称小菌)的生 长和2-KGA的产率得到很大提高。混合菌中的大菌没有任何产生2-KGA的能力，其主要作 用是辅助小菌生长，小菌是2-KGA的产生菌，大菌对小菌生长和产酸的作用机理仍然没有 搞清楚。本发明通过建立高通量的发酵评价技术平台，对可能辅助小菌生长和产酸的营养 物质进行了大规模筛选，首先发现了谷胱甘肽对于小菌产酸的活性，并将这一发现共享给 天津大学，天津大学做了后续研究，发现了含巯基化合物对小菌的生长刺激作用，并申请了 专利(200910069697.7)。随后发现，原儿茶酸(3，4_ 二羟基苯甲酸)具有刺激小菌生长产 酸的活性.进一步又发现琥珀酸、L-苹果酸、延胡索酸、草酰乙酸，具有明显促进小菌生长 和产酸的功能，其促进作用达到或超越了芽孢杆菌的伴生效果。总结这些化合物的特征，与 三羧酸循环关系密切四碳二羧酸效果较好，但是，除了这些四碳二羧酸之外，含有一些有机 物，例如原儿茶酸，丁二醇，也具有促进小菌生长和产酸的活性。(1)琥珀酸，又称1，4- 丁二酸，分子式C4H6O4,分子量118，白色结晶或结晶粉末，是 一种具有广泛用途的有机化工原料，主要用于制备琥珀酸酐、醇酸树脂、油漆、染料、食品调 味剂等，医药工业中可用它生产磺胺药、维生素A、维生素B等抗痉挛剂、松痰剂、利尿剂和 止血药物，还可用于生产润滑剂和表面活性剂的原料。在生物体内，琥珀酸是三羧酸循环的 重要中间产物，经由α-酮戊二酸脱羧、或者异柠檬酸裂解而来，琥珀酸脱氢可形成延胡索 酸。(2)延胡索酸，又称反丁烯二酸、富马酸，分子式C4H6O4,分子量116，无色晶体，用 于生产不饱和聚酯树脂、粘合剂、增塑剂等，是精细化学品的中间体，在医药工业中用于解 毒药二巯基丁二酸、反丁烯二酸铁的生产，也可作为一种食品添加剂。在生物体内，延胡索 酸是三羧酸循环的重要中间产物，它来自琥珀酸的脱氢，经过水合后产生L-苹果酸。(3)苹果酸，又称2-羟基丁二酸，分子式C4H6O5,分子量134，由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。自然界中以D-苹果酸、L-苹果酸和DL-苹果酸三种形式 存在。最常见的是L-苹果酸，存在于不成熟的的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中，易被人体 吸收。L-苹果酸可用于食品添加剂、化妆品、保健品、饲料添加剂等，也可用于治疗肝病、贫 血等多种疾病。在生物体内，L-苹果酸是三羧酸循环的重要中间产物，由延胡索酸水合后 产生，经脱氢后形成草酰乙酸。 (4)草酰乙酸，又称2-氧代丁二酸，2-羰基丁二酸，分子式C4H4O5,分子量132，是 三羧酸循环的一个中间产物。可以在苹果酸脱氢酶的催化下由苹果酸生成，或在丙酮酸羧 化酶的作用下，由丙酮酸与CO2生成，另外，也在转氨酶(EC2.6. 1. 1)的作用下由天冬氨酸 生成，目前主要用于化学试剂。(5)原儿茶酸又称3，4- 二羟基苯甲酸，分子式C7H6O4,分子量154，白色至褐色结 晶性粉末，在空气中变色。存在于鳞始蕨科植物乌蕨的叶，冬青科植物冬青的叶等植物中。 具有抗菌作用，体外试验时对部分致病菌有不同程度的抑菌作用，也用于治疗慢性气管炎。 工业上可用做食品添加剂、染料及医药中间体。(6)马来酸又称顺丁烯二酸，分子式C4H6O4,分子量116，无色晶体，用于生产各种 化学品的中间体。(7)1，4_ 丁二醇分子式=C4HltlO2,分子量90，液体产品，为一种基本的化工及精细 化工原料，用于生产工程塑料及纤维以及农药、医药和化妆品等领域。本发明公开之前，没有任何文献报道上述化合物和小菌生长产酸之间的紧密关 联。以上构成了本发明的技术背景。
本发明目的在于一种发酵制备2-KGA的营养强化培养基，该营养强化培养基可促 进小菌生长，使小菌脱离对伴生菌的依赖，建立独立生长并为2-KGA发酵工艺的改进提供 ■石出。为实现上述目的，本发明的发酵制备2-KGA的营养强化培养基，是在以山梨醇或 山梨糖为底物的常规培养基中加入了营养强化剂。上述营养强化剂为原儿茶酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸、马来酸、草酰乙酸及其盐 的至少一种，以及1，4-丁二醇。作为上述方式的进一步限定，营养强化剂的添加量为50mg/L-20000mg/L(即 0. 005% -2% )，当营养强化剂的添加量低于50mg/L时，对小菌必要的生长支撑作用不足， 影响产酸，但添加量高于20000mg/L时，超过了小菌的最大需求，增大了发酵液的渗透压， 同样影响小菌的生长和产酸。常规培养基中的底物可以是D-山梨醇、L-山梨糖或者D-山梨醇与L-山梨糖的 混合物，浓度范围从-15%，种子培养基中一般不超过5%，发酵培养基中一般不超过 10%。培养基中的氮源可以采用尿素、玉米浆、酵母膏或酵母粉等酵母浸出物、牛肉膏、蛋白 胨、其它动物、植物、或微生物来源的含有复合氨基酸制品、其它化学合成来源的氨基酸或 复合氨基酸制品；它们可以根据培养基设计的总体情况而全部使用或者部分地使用。一般 情况下，尿素0. 到2.0%;玉米浆(或者酵母膏或酵母粉等酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨、 复合氨基酸等其它有机氮源)0. 2% -2%。培养基中的无机盐主要包括磷酸盐和硫酸盐，一般可以是磷酸二氢钾和硫酸铵，其用量为磷酸盐0. 02%到0. 5%，硫酸盐0. 02%到0. 5%。 根据培养基设计的总体情况、特别是玉米浆等有机氮源的质量和产地情况有选择性地补充 添加维生素，包括VBp VB2, VB5, VB6, VB12、维生素PP、生物素、叶酸、硫辛酸。添加量的范围 一般从10μ g/L到10mg/L。有些维生素是一类在化学结构上具有相同的基本结构的系列 衍生物，例如维生素B6可以是吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺的形式，维生素PP可以是烟酸、烟 酰胺的形式，VB12的可以是氰钴胺素、腺苷钴胺素、甲基钴胺素、羟基钴胺素的形式，叶酸可 以是四氢叶酸、二氢叶酸、亚叶酸的形式。一些富含这些维生素的天然来源的混合物都可以 起到与纯品相同或近似功效，如酵母膏、酵母粉、果蔬汁等。根据培养基设计的总体情况、 特别是玉米浆等有机氮源的质量和产地情况有选择性地补充添加。微量元素，包括铁离子、 锌离子、锰离子、铜离子、镍离子、钼离子、钴离子，一般以水溶性盐的形式添加，添加范围从 lyg/L到10mg/L，离子的过量会引起副作用。pH调节剂可以选用碳酸钙、氢氧化钠、碳酸 钠、氨水等作为培养基配制时的PH调节剂，用量适量即可。消泡剂可以选用植物油或其它 消泡剂，用量适量即可。所述培养基的配制步骤为 1、采用常规原料配制出基本培养基；2、向其中加入营养强化剂；或者，采用含有营养强化剂的培养基制品，例如玉米浆 等，间接配制出该强化培养基；3、培养基的灭菌采用过滤除菌或者蒸汽灭菌，蒸汽灭菌时需要把氮源、底物和维 生素分开灭菌。上述中，营养强化剂的加入是本发明的重点。营养强化剂加入的时机既可以在发 酵开始之前，也可以在发酵开始之后以补料方式加入。此外，本发明还提供了一种利用上述营养强化培养基发酵制备2-KGA的方法，其 步骤为1、将普通生酮古龙酸杆菌(Ketogulonigenium vulgare)等必要微生物菌种接入 上述培养基；2、按常规方法进行发酵控制；3，按常规方法进行2-酮-L-古龙酸的提取精制；为了更好的阐述本发明的实质，下面将通过营养强化剂促进小菌生长的实验及结 果来说明本发明的原理1、菌种小菌、大菌2、固体培养基(质量体积百分数)山梨糖2 %，玉米浆1 %，酵母粉1 %，尿素1 %， 磷酸二氢钾0. 1%，硫酸铵0. 1%，碳酸钙0.3%，微量元素及维生素各lml/L，琼脂1.8%， ρΗ7· 0。 3、基础液体培养基(质量体积百分数)山梨糖5%，玉米浆1 %，尿素1 %，磷酸二 氢钾0. 1%，硫酸铵0. 1%，碳酸钙0.3%，微量元素母液及维生素母液各lml/L，pH7.0。4、各种营养强化剂分别配制成5%母液备用。5、培养基及营养强化剂母液，121°C常规灭菌25min，山梨糖、尿素和其它组分分别 灭菌。6、大菌和小菌分别接种在固体培养基上28°C，培养24_36h。7、将固体培养基上的大菌、小菌菌苔分别制成菌悬液，取小菌菌悬液Iml接入基 础液体培养基，各取大菌、小菌Iml混合接入基础液体培养基，三角瓶装液量25ml/250ml。 8、取7中制备的小菌菌悬液，各Iml分别接入多瓶基础液体培养基，再分别加入 Iml营养强化剂，三角瓶装液量25ml/250ml，28°C -30°C、摇床转速180_200rpm，震荡培养 48-60h。9、发酵过程检测残糖、2-KGA含量，pH值，并镜检菌体形态。
10、2-KGA检测方法取2ml发酵液放入试管中，加入7mol/L硫酸溶液2ml，摇勻 后，沸水浴25min，自来水迅速冷却，分次加入蒸馏水并转移到250ml三角瓶中，蒸馏水总体 积共25ml，加入的可溶性淀粉2ml，摇勻后用0. 05mol/L碘液滴定到蓝色30s不退色为 终点，记录所用碘液的体积数。配制不同浓度的标准2-酮基-L-古龙酸溶液，重复上述过 程，获得标准曲线，由标准曲线可以计算出发酵液样品的2-KGA的含量(mg/mL)。11、山梨糖测定采用还原糖的测定方法-DNS法12、发酵测定结果见表1 表1各种营养强化剂对小菌生长和产2-KGA的影响 由表1的结果可知，以5%的山梨糖为底物，小菌在这些营养强化剂的存在下，都 有不同程度的促进作用，其中琥珀酸、延胡索酸、L-苹果酸的促进效果更为明显，已经达到 或超越大菌的伴生作用。镜检表明，培养基中存在这些营养强化剂，菌体形态正常，菌体数量也明显增多，说明产酸的增加与菌体浓度直接相关。营养强化剂促进小菌生长的实验结 果表明，其中琥珀酸对小菌生长和产酸的促进作用最为明显，因此以下以琥珀酸钠为营养 强化剂的代表实施


所用菌种小菌和大菌步骤1培养基配制与灭菌固体培养基(质量体积百分数)山梨糖2%，玉米浆 1%，酵母粉1%，尿素1%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸铵0. 1%，琥珀酸钠0. 1%，琼脂1.8%， PH7.0。液体种子培养基(质量体积百分数)山梨糖5%，玉米浆1.2%，尿素1.2%，琥珀 酸钠0. 15%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸铵0. 1%，碳酸钙0.3%，微量元素及维生素各Iml/ L，pH7.0。液体发酵培养基(质量体积百分数)山梨糖8%，玉米浆1%，尿素1%，琥珀酸 钠0. 15%，磷酸二氢钾0. 1%，硫酸铵0. 1%，碳酸钙0.3%，微量元素及维生素各lml/L， ρΗ7· 0。培养基常规灭菌，12ΓΟ,25πι η,固体培养基灭菌后制成平板。10升发酵罐，蒸汽空消30mi n，液体发酵培养基装入发酵罐中，121 °C灭菌25min， 山梨糖、尿素与其他培养基成分分开灭菌。步骤2菌种制备与发酵大菌和小菌分别接种在固体培养基上28°C，培养36h ；固 体培养基生长的大菌、小菌分别制成菌悬液，各取5ml混合接入液体种子培养基；装液量 75ml/500ml,28°C -30°C、摇床转速 180_200rpm，培养 18_20h，5 %接种量接入 IOL 发酵罐， 280C -30°C，250-300rpm，氢氧化钠自动调节 pH7. 2。步骤3提取精制2-KGA 依常规方法进行，包括絮凝、过滤、离子交换、脱色、浓缩、结晶。检测方法取2ml发酵液放入试管中，加入7mol/LH2S04溶液2ml，摇勻后，沸水浴 25min,自来水迅速冷却，分次加入蒸馏水并转移到250ml三角瓶中，蒸馏水总体积共25ml， 加入1 %的可溶性淀粉2ml，摇勻后用0. 05mol/L碘液滴定到蓝色30s不退色为终点，记录 所用碘液的体积数。配制不同浓度的标准2-酮基-L-古龙酸溶液，重复上述过程，获得标 准曲线，由标准曲线可以计算出发酵液样品的2-KGA的含量(mg/mL)。结果培养基中加入琥珀酸钠可以明显提高小菌的产酸速率，缩短发酵周期，最终 2-KGA效价达到74. 5mg/ml,比常规的大小菌混合培养提高4. 9%、发酵周期缩短至48h。实施例二 采用琥珀酸钠建立从山梨糖到2-KGA的“纯种发酵新工艺”所用菌种小菌步骤1培养基配制与灭菌同实施例一。步骤2菌种制备与发酵小菌接种在固体培养基上28°C，培养36h，制成菌悬液，接 入液体种子培养基；装液量75ml/500ml，28°C -30°C、摇床转速180_200rpm，培养18_20h， 5%接种量接入IOL发酵罐，28°C -30°C，250-300rpm，氢氧化钠自动调节pH7. 2。步骤3提取精制2-KGA 依常规方法进行，包括絮凝、过滤、离子交换、脱色、浓缩、结晶。检测方法同实施例一。结果在没有芽孢杆菌伴生的条件下，琥珀酸钠同样可以极大提高小菌的产酸速 率，缩短发酵周期，实现了小菌的独立培养，最终2-KGA效价达到75. 2mg/ml,比常规的大小 菌混合培养2-KGA产量提高5. 0%，比常规的大小菌混合培养发酵周期缩短10h。“纯种发 酵新工艺”避免芽孢杆菌对营养的消耗、避免芽孢释放和细胞自溶引起的醪液杂质复杂，降 低产物2-KGA分离难度。实施例三采用琥珀酸钠建立从山梨醇到2-KGA的“单菌一步发酵 ”新工艺所用菌种小菌步骤1培养基配制与灭菌采用山梨醇代替山梨醇，其它同实施例一。步骤2菌种制备与发酵小菌接种在固体培养基上28°C，培养36h，制成菌悬液； 接入液体种子培养基，装液量75ml/500ml，28°C -30°C、摇床转速180_200rpm，培养18_20h ； 将摇瓶种子5% (ν/ν)接入500mlpH自控摇瓶，30°C，200rpm，氢氧化钠自动调节pH7. 2。步骤3提取精制2-KGA 依常规方法进行，包括絮凝、过滤、离子交换、脱色、浓缩、 结晶。检测方法同实施例一。结果表明2-KGA效价达到45. 2mg/ml。利用琥珀酸，实现了从山梨醇到2-KGA的
“单菌一步发酵”新工艺。实施例四采用琥珀酸钠建立从山梨醇到2-KGA的“双菌一步发酵”新工艺所用菌种小菌,醋酸菌 Acetobacter melanogenum Asl. 114步骤1培养基配制与灭菌同实施例三。步骤2菌种制备与发酵冷冻管保藏的小菌及醋酸菌分别接种在固体培养基上 28°C，培养36h ；分别取固体培养基上的小菌及醋酸菌，各制成菌悬液1ml，混合接入液体种 子培养基，装液量25ml/250ml，3(TC、摇床转速200rpm，培养18_20h，按5%接种量，将混合 培养的摇瓶种子接入500mlpH自控摇瓶，30 0C，200rpm,氢氧化钠自动调节pH7. 2，培养60h。步骤3提取精制2-KGA 依常规方法进行，包括絮凝、过滤、离子交换、脱色、浓缩、 结晶。检测方法同实施例一。结果表明2_KGA效价达到70. 6mg/ml。利用琥珀酸，经小菌和醋酸菌的混合发酵， 实现了从山梨醇到2-KGA的“双菌一步发酵”新工艺。比较实施例三和实施例四，可以看出，单独采用小菌就可以完成由山梨醇到2-KGA 发酵的一步发酵，但是，其转化效率有些低，借助醋酸菌的协助，在混合发酵模式下，一步发 酵的效率得到提升，达到了 “二步发酵法”的产酸水平，但工艺更加简单。


本发明涉及发酵工程与生物技术领域内的一种培养基，尤其是一种发酵制备2-KGA的营养强化培养基，该营养强化培养基包括以山梨醇或山梨糖为底物的常规培养基和营养强化剂。同时本发明还涉及一种应用该强化培养基制备2-KGA的方法。该营养强化培养基可促进小菌生长，使小菌脱离对伴生菌的依赖，建立独立生长并为2-KGA发酵工艺的改进提供基础。