专利名称：椰子成熟合子胚离体培养体细胞胚胎发生方法椰子(Cocos nucifera L.)属棕榈科椰子属单子叶植物,是一种具有经济价值高、产品利用率高的热带木本油料与食品能源作物。椰子多数品种为异花授粉植物，生长周期长，繁殖系数低，杂种后代性状分离严重，个体差异较大，很难获得同一性状后代群体，且椰果个大、易萌发、不耐贮藏、运输，这些特性对椰子的种质资源收集、交换和保存带来很大困难。利用组织培养技术可固定椰子某些优良性状，继而进行培养繁殖，在生产上能够大量繁殖高产、抗寒、抗风等椰子优良品种，同时可使椰子种质资源的收集和保存简便化，提高椰子种质资源交流的安全性。 椰子组织培养技术的研究工作始于二十世纪50年代，世界各国先后用花的分生组织、叶外植体、椰子成熟合子胚进行体外培养，都在不同程度上获得成功。80年代末菲律宾利用软肉椰果的胚进行组培获得了成功，已有植株移栽大田。90年代初斯里兰卡椰子研究所组培室采用未成熟的椰子胚进行组织培养也取得了新的进展。90年代中期，欧洲与生产国合作开展椰子组织培养技术攻关，研究项目已被列入欧洲科技发展计划，该项目由欧共体资助，目的在于加深对椰子体细胞胚胎发生的技术研究。Branton和Blake首次报道可通过未成熟花序组织进行体细胞胚胎发生，Verdeil J L等以椰子未成熟花序为外植体，经间接体细胞胚胎途径实现植株再生，Adkins S W等以椰子未成熟合子胚为外植体，诱导出愈伤组织和体细胞胚胎发生，Karunaratne S等利用6 7个月的椰子坚果切离的胚为离体培养材料，研究了椰子未成熟胚的培养、愈伤组织增殖及体细胞胚胎发生。而有关利用椰子成熟合子胚为外植体诱导体细胞胚胎发生的研究，目前国内外均未见相关报道。
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种椰子成熟合子胚离体培养体细胞胚胎发生方法，解决了利用椰子未成熟花序或幼胚等获得体细胞胚的外植体采集时间受季节限制的问题，为深入开展椰子的基因工程、遗传转化、品种改良等方面的研究提供了一条有效途径。一种椰子成熟合子胚离体培养体细胞胚胎发生方法，包括胚的采集与预培养过程、胚性愈伤组织的诱导过程、体细胞胚胎发生过程，其步骤如下I、胚的采集与预培养过程选取10 11月龄的成熟椰果，取出内有完整胚的固体胚乳块，清洗后取出胚消毒，然后接种到预培养基中，置于相对湿度为70 80%、温度25 29°C的条件下进行暗培养12 17天，使胚膨大。所述预培养基是以Y3培养基为基本培养基，并添加活性炭2. 5g/L、鹿糖 60g/L。2、胚性愈伤组织的诱导过程取经过预培养的膨大的胚，将其吸器切除并纵切成两半，切面朝上接种到愈伤组织诱导培养基中，置于相对湿度为70 80%、温度25 29°C的条件下进行暗培养170 200天产生淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织。所述愈伤组织诱导培养基是以Y3培养基为基本培养基，并添加 2，4-D 25mg/L、活性炭 2. 5g/L、PVP 5g/L、琼脂 4. 5g/L、蔗糖 30g/L。3、体细胞胚胎发生过程将胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基中，置于相对湿度为70 80%、温度25 29°C、光照强度1500 25001x、光照12h/d的条件下培养80 100天形成体细胞胚。所述体胚诱导培养基是以Y3培养基为基本培养基，并添加6-BA 10mg/L、2，4-D 2mg/L、活性炭2.5g/L、PVP 5g/L、琼脂 4. 5g/L、蔗糖 30g/L。本发明工艺简单，利用椰子成熟合子胚为外植体诱导体细胞胚胎发生，解决了利用椰子未成熟花序或幼胚等获得体细胞胚的外植体采集时间受季节限制的问题，为深入开展椰子的基因工程、遗传转化、品种改良等方面的研究提供了一条有效途径。作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一I、胚的采集与预培养过程选取10 11月龄的成熟椰果90个,去掉椰果外皮并用砍刀将椰果横向裂开,用直径为2 cm的打孔器取出内有完整胚的固体胚乳块，用自来水冲洗I 2h，然后在超净工作台上取出胚并进行胚表面消毒，再接种到预培养基(Y3培养基+活性炭2. 5g/L+蔗糖60g/L)中，置于相对湿度为75%、温度26°C的条件下进行暗培养15天，使胚膨大。2、胚性愈伤组织的诱导过程取经过预培养的膨大的胚，将其吸器切除并纵切成两半，切面朝上接种到愈伤组织诱导培养基(Y3培养基+2，4-D 25mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相对湿度为70%、温度27°C的条件下进行暗培养180天，产生淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织，结果见表I。3、体细胞胚胎发生过程取胚性愈伤组织50个转接到体胚诱导培养基(Y3培养基+6-BA 10mg/L+2, 4-D2mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相对湿度为75%、温度25°C、光照强度23001x、光照12h/d的条件下培养90天形成体细胞胚，结果见表2。实施例二I、胚的采集与预培养过程选取10 11月龄的成熟椰果90个，去掉椰果外皮并用砍刀将椰果横向裂开，用直径为2 cm的打孔器取出内有完整胚的固体胚乳块用自来水冲洗I 2h，然后在超净工作台上取出胚并进行胚表面消毒，再接种到预培养基(Y3培养基+活性炭2. 5g/L+蔗糖60g/L)中，置于相对湿度为80%、温度28°C的条件下进行暗培养16天，使胚膨大。2、胚性愈伤组织的诱导过程取经过预培养的膨大的胚，将其吸器切除并纵切成两半，切面朝上接种到愈伤组织诱导培养基(Y3培养基+2，4-D 25mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相对湿度为75%、温度25°C的条件下进行暗培养190天，产生淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织，结果见表I。3、体细胞胚胎发生过程取胚性愈伤组织50个转接到体胚诱导培养基(Y3培养基+6-BA 10mg/L+2, 4-D2mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相对湿度为70%、温度27°C、光照强度20001x、光照12h/d的条件下培养80天形成体细胞胚，结果见表2。实施例三
I、胚的采集与预培养过程选取10 11月龄的成熟椰果90个,去掉椰果外皮并用砍刀将椰果横向裂开,用直径为2 cm的打孔器取出内有完整胚的固体胚乳块用自来水冲洗I 2h，然后在超净工作台上取出胚并进行胚表面消毒，再接种到预培养基(Y3培养基+活性炭2. 5g/L+蔗糖60g/L)中，置于相对湿度为80%、温度25°C的条件下进行暗培养13天，使胚膨大。2、胚性愈伤组织的诱导过程取经过预培养的膨大的胚，将其吸器切除并纵切成两半，切面朝上接种到愈伤组织诱导培养基(Y3培养基+2，4-D 25mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相对湿度为75%、温度26°C的条件下进行暗培养200天产生淡黄色颗粒状的胚性愈伤组织，结果见表I。3、体细胞胚胎发生过程取胚性愈伤组织50个转接到体胚诱导培养基(Y3培养基+6-BA 10mg/L+2, 4-D2mg/L+活性炭2. 5g/L+PVP 5g/L+琼脂4. 5g/L+蔗糖30g/L)中，置于相对湿度为78%、温度28°C、光照强度18001x、光照12h/d的条件下培养100天形成体细胞胚，结果见表2。对比及结果胚性愈伤组织诱导率在培养期间以不同的转接频率为对照组，其他条件同实施例一，胚性愈伤组织诱导时间6个月(180天)。所得诱导率见表I。表I不同转接频率的胚性愈伤组织诱导率的比较


本发明属于农业生物技术领域，涉及一种椰子成熟合子胚离体培养体细胞胚胎发生方法，是选取成熟椰果，取出胚接种到预培养基中进行暗培养使胚膨大；取经过预培养的膨大的胚，将其吸器切除并纵切成两半，切面朝上接种到愈伤组织诱导培养基中进行暗培养得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到体胚诱导培养基中培养80～100天形成体细胞胚。本发明工艺简单，利用椰子成熟合子胚为外植体诱导体细胞胚胎发生，解决了利用椰子未成熟花序或幼胚等获得体细胞胚的外植体采集时间受季节限制的问题，为深入开展椰子的基因工程、遗传转化、品种改良等方面的研究提供了一条有效途径。