专利名称：用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记二及其用途的制作方法甜瓜(Cocumis melo L.)作为葫芦科(Cucurbitaceae)植物中一种重要的园艺作物，具有较高的商业品价值和经济价值，是我国重要的经济作物之一。近年来随着甜瓜种质资源商品化和种植面积的不断扩大，病虫害发生日益严重，迫使生产上大量使用化学试剂，严重影响了甜瓜的产量和品质(Sherf and MacNab 1986)。其中甜瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌导致的一种世界范围内毁灭性的土传病害，导致甜瓜90%以上的经济损失 (Leach JG1938 ；Martyn RD 1987)。目前已经鉴定分离得到4种枯萎病菌生理小种，分别为生理小种0，1，2和1-2。遗传分析表明，2个独立的基因Fom-I和Fom-2分别控制对生理小种 0，2 和 0，1 的抗性(Risser et al. 1976 ；Risser and Mas 1965 ；Robinson et al. 1976)。其中！^0111-2基因已经通过图位克隆的方法得到分离(Joobeur et al. 2004)。 Fom-2 基因属于 NBS-LRR 类的 R 基因，这类基因编码 NBS (nucleotide binding site, NBS) 和LRRdeucine-rich repeat, LRR)两个比较保守的结构域。通常植物专化抗性是由于宿主对抗性蛋白产生的无毒基因的识别，进而引发一个信号级联反应和防御反应(Hammond Kosack and Jones 1997 ；Martin et al. 2003)。植物的R基因不断变化来识别产生变异的无毒基因，这有利于人们在分子水平上发现和认识自然选择。现在人们已从许多物种中克隆得到R基因，并验证了它们在抗性和不抗材料间的功能多样性。许多研究表明拟南芥和其他几个物种R基因存在序列的多态性，这种种间或种内影响表型的基因序列多态性的识别有利于功能性分子标记的发展(Andersen and Lubberstedt，2003)。目前培育优良抗枯萎病甜瓜品种成为解决甜瓜枯萎病害问题的有效途径之一，分子辅助选择(MAQ手段的发展能大大缩短甜瓜枯萎病抗性育种进程。但目前抗病育种过程中所使用的分子标记与目标基因存在一定遗传距离，易发生重组交换而分离，从而影响选择的准确性。功能性分子标记是与表型相关的功能基因基序中功能性单核苷酸多态性位点开发而成的新型分子标记，功能性分子标记的开发首先需要鉴定出群体中与表型相关的功能基因的功能性基序的序列。AS-PCR和CAPS方法已成功应用于基于SNPs的一系列功能性分子标记的开发(Chiapparino et al. 2004 ；Kim et al. 2006 ；Yeam et al. 2005)。功能性分子标记不需要复杂昂贵的仪器设备或繁琐的操作步骤，因此非常适合应用于分子育种过程。随着越来越多的功能基因及其等位基因的分离和注释，功能性分子标记已成为一类新3型分子标记，可以大大提高标记的效率。
本发明要解决的技术问题是提供一种与甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2相关的功能性分子标记，其适用于甜瓜的抗枯萎病的辅助选择。为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记，该分子标记所采用的CAPS引物序列为以下任意一种CAPSl 正向引物为 5，-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3，(SEQ ID NO 3)反向引物为5，-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3，(SEQ ID NO 4),CAPS2 正向引物为 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，(SEQ ID NO 5)反向引物为5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，(SEQ ID NO 6),CAPS3 正向引物为 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，(SEQ ID NO 7)反向引物为5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，(SEQ ID NO 8)；或者，该分子标记所采用的AS-PCR引物序列为AS-PCR 正向引物为 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，(SEQ ID NO 9)反向引物为5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，(SEQ ID N0:10)。本发明还同时提供了上述功能性分子标记的用途用于甜瓜枯萎病的分子辅助育种，或者用于鉴定甜瓜枯萎病抗性基因。发明人发现了甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2在抗病与感病种质的LRR区域有3个 SNP位点，甜瓜枯萎病抗性基因i^om-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1所述。枯萎病抗性和感病材料在序列表SEQ ID NO 1的^lbp处有一个A-G的碱基突变，在1075bp处有一个A-G的碱基突变，在1216bp处有一个T-C的碱基突变(图1)。突变后的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :2所述。根据上述SEQ ID NO 1的序列的SNP特征，分别设计引物，开发FMs，所述的CAPS 和AS-PCR方法的引物对分别为CAPSl 正向引物为 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，反向引物为5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，；CAPS2 正向引物为 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，反向引物为5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，；CAPS3 正向引物为 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，反向引物为5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，。AS-PCR 正向引物为 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，反向引物为5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，。该CAPS及AS-PCR引物对能成功鉴定出甜瓜抗病及感病种质(图2、3)，并且在F2 世代中呈单基因遗传分离规律(表1、2)，应用上述两种方法可以成功鉴定出甜瓜种质对枯萎病抗性的基因型(表3)。4下面结合附图对本发明的
作进一步详细说明。图1是本发明的甜瓜抗病及感病种质i^om-2基因LRR区域SNP位点图；图1中fom-2-R代表枯萎病抗病基因型，Fom-2-S代表枯萎病感病基因型；图2是CAPS方法鉴定甜瓜抗病及感病种质对比图；图2中FF为抗病纯合基因型，Ff为抗病杂合基因型，ff为感病纯合基因型，M为 DNA分子量标准；图3是AS-PCR方法鉴定甜瓜抗病及感病种质对比图；图3中FF为抗病纯合基因型，Ff为抗病杂合基因型，ff为感病纯合基因型，M为 DNA分子量标准。

Fom-2 正向引物GAGTCTATTGTTTCGCTTC反向引物TGCTCGTCTCTGGGTCACCTTC。(3)基因组DNA的提取(a)分别取0. 5g上述甜瓜抗病(Cantaloupe，高抗枯萎病材料)和感病种质(仙果027-5，高感枯萎病材料)、Fp F2的不同甜瓜种质嫩叶于研钵中，液氮状态下研磨，加入 600 μ 1 65°C预热的2 X CTAB (30 μ 1巯基乙醇混勻)，转移到离心管中，65°C保温1小时。(b)加入600 μ 1的氯仿异戊醇(24/1的体积比)轻轻摇勻，4°C，13000rpm离心， 10分钟。(C)取上清，重复(b)步骤一次。(d)取步骤(C)所得的上清于另一离心管中，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混勻，静置5分钟，13000rpm，离心10分钟。(e)倒去上清，加入700 μ 1 Wash Buffer漂洗DNA沉淀，离心，重复一次。(f)加 15 μ ITE-Rnase, 37°C保温 1 小时。(g)力口入 2mol/L NaCl 100 μ 1+100 % 乙醇 250 μ 1 混勻，-20 °C 静置 30min， 13000rpm离心10分钟。(h)倒去上清，加入500 μ 1 70% (体积比)乙醇，漂洗，倒去乙醇，重复一次，常温晾干。
⑴加入30-50 μ 1 ddH20或TE,回溶，_20°C保存备用。注2XCTAB配方CTAB 4gIM Tris-HCl (pH8. 0) 20mlEDTA 1. 488gNaCl 16. 352g先用70ml ddH20溶解，再定容至200ml灭菌，冷却后0. 2_1%2_巯基乙醇000 μ 1) 氯仿-异戊醇04 1)先加96ml氯仿，再加細1异戊醇，摇勻即可。TE-Rnase :15 μ 1 TE 力口入 1/100 体积的 Rnase0Wash Buffer IOmmol/L 乙酸氨75 % (体积比)乙醇(4)链式聚合酶反应(PCR)的试剂与条件首先将下列试剂混和在一起
IOxTaq DNA聚合酶缓冲液5 μ
模板DNA1 μ1
正向引物(1.25昭/1)0.4 μ
反向引物(1.25昭/1)0.4 μ
脱氧核苷酸混合物(dNTP)1 μ1
Taq DNA 聚合酶0.4 μ
灭菌水41.8 μ
总体积50 μ PCR反应条件为94°C预变性:3min后，94 °C变性30s，50°C退火45s，72 °C延伸 1. 5min，35个循环后72°C延伸lOmin。PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳检测。对目的条带进行克隆测序，具体方法如下(a)连接反应，离心管顺序加入以下各组分H2O 2 μ 1T4DNALigase IOXBuffer 1 μ 1pUCM-T 载体1 μ 1PCR 产物4 μ 1PEG4000 1 μ 1T4DNALigase 1 μ 1 ；(b)感受态细胞的制备(CaCl2法制备感受态细胞):①挑取新活化的E. coli DH5a单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37°C下振荡培养1 左右，直至对数生长后期。②将菌液以1 100-1 150的比例(重量比)接种于IOOml LB液体培养基中， 37°C下振荡培养2h左右，至0D600 = 0. 5左右。
③将培养液转入离心管中，冰上放置lOmin，然后于4°C下IOOOOrpm离心lOmin。④弃上清，用预冷的0. lmol/L的CaC12溶液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置IOmin 后，4°C下IOOOOrpm离心lOmin。重复操作一次。⑤弃上清，加3ml预冷的含15% (体积比)甘油的0. lmol/L的CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置5min后，即成感受态细胞，分装成200 μ 1的小份，置于_70°C保存备用。(c)热激法转化大肠杆菌DH5 α ①取上述(b)步骤制备的感受态细胞悬浮液200 μ 1，摇勻后加入4μ 1上述(a)步骤的连接产物，用枪头轻轻吹打均勻，冰浴30分钟； ②42 °C保温90秒，迅速放入冰中，冰浴5分钟；③加入37°C预热的Iml LB液体培养基(Amp_)，混勻，37 °C保温1个小时，使细胞恢复正常生长状态；④ 3000rpm 离心 10 分钟；⑤弃去上清，余下的200 μ 1用枪头轻轻吹打均勻，使细菌充分悬浮后均勻涂布于含 15 μ 1 X-Gal (20mg/ml)禾Π 100 μ 1 IPTG (24mg/ml)的 LB 筛选平板培养基上(Amp+)；⑥37°C正面向上放置半个小时后，倒置培养8-12小时，观察。LB培养基配方IOOrnl体系中加入以下各组分蛋白胨(Typtone)Ig酵母提取物(YeastExtract) 0. 5gNaCl IgNaOH(lmol/L) 100 μ 1先用70ml ddH20溶解，再定容至100ml，高压高温灭菌后4°C保存。(5)质粒纯化(a)在超净工作台中用无菌枪头挑取单个白色菌落，接种于含50μ g/ml Amp的 5mlLB培养液中，37°C培养过夜。(b)取 l_2ml 菌液于 Epeendorf 管中，12000rpm 离心 1 分钟；(c)加入100 μ 1 Solution I，用枪头充分悬浮菌液；(d)加入 200 μ 1 Solution II，颠倒 Epeendorf 管，冰浴 3 分钟；(e)加入 150 μ 1 预冷的 Solution III，颠倒 Epeendorf 管，冰浴 5 分钟；(f) 40C，12000rpm离心5分钟，上清液加入等体积的苯酚/氯仿混勻；(g) 40C，12000rpm离心5分钟，上清液加入2倍体积的乙醇，室温放置5分钟；(h)4°C，12000rpm离心5分钟，用70%乙醇漂洗一下，凉干沉淀，50 μ 1 TE融解沉淀，-20°C保存备用。其中Solution I :100ml 体系lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0) 2.5ml0. 5mol/L EDTA (pH8. 0) 2. 0ml20% Glucose (1. llmol/L) 4.5mldH20 91ml
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高温高压灭菌后4°C保存。Solution II :100ml 体系10% SDS IOml2mol/LNaOH IOml加灭菌水至100ml，充分混勻，室温保存，最好现用现配。Solution III :100ml 体系:KOAc 29. 4gCH3COOH 11.5ml加灭菌水至100ml，高温高压灭菌后4°C保存。序列测定与分析序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。将所得序列在 Genebank及分子生物学软件DNAMAN、Clustalff等分析，得到SNP位点信息(图1)。￠) CAPS 方法采用dCAPS 2. 0(http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps. html)软件设计引物， 引物序列如下CAPS 1 正向引物 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，反向引物5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，CAPS2 正向引物 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，反向引物5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，CAPS3 正向引物 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，反向引物为5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，反应体系和条件同上，PCR产物分别采用AccI，EcoRI和)(baI限制性内切酶进行酶切，三种内切酶均采用20 μ 1的反应体系如下反应体系
PCR 产物5-10μ1
0.1% BSA2μ1
IOxbuffer2μ1
酶5U补充dd H2O 至 20μ 1 ；将混合溶液置于37 °C，TaqI体系置于65 °C条件下各保温4小时，产物采用 HDA-GT 12TM(eGene，USA)毛细管电泳系统进行检测。利用CAPS标记分析F2群体遗传规律，3个SNP位点均呈1:2:1的分离比例 (表1)，符合孟德尔单基因遗传规律，因此CAPS方法可以有效区分抗性和敏感植株。表1、CAPS方法鉴定的SNP位点在F2世代中遗传分离
位点引物FF类型Ff类型ff类型有效值比例位点1CAPSl234725951:2:1
8位点 2CAPS2 21 「48 「25 「94 T 1 2 1
位点 3CAPS3 234623921:2: 1(7) AS-PCR 方法将SNP位点置于引物的3’端，合成等位基因特异性引物，我们在位点2和3处设 计了 5条AS-PCR引物，配对得到6个引物组合，优化PCR反应条件，筛选到一条特异性引物 对，通过PCR方法直接区分高抗和高感种质。引物对序列如下AS-PCR 正向引物为 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，反向引物为5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3， PCR反应体系(25 U 1)如下


本发明公开了用于甜瓜枯萎病抗性鉴定的功能性分子标记二，该分子标记二所采用的引物序列为CAPS2正向引物为5’-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3’，反向引物为5’-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3’。该功能性分子标记二用于甜瓜枯萎病的分子辅助育种，或者用于鉴定甜瓜枯萎病抗性基因。