维生素c在抑制农药ddt肝脏毒性中的应用的制作方法[0002]DDT,又称二氯二苯三氯乙烷，是有机氯杀虫剂的一种，于1874年首次合成，最初被用于消灭疟疾等虫媒传染病，第二次世界大战后，其作为一种有效杀虫剂，广泛应用于农业。但是从20世纪60年代开始，人们逐渐发现，随着该类农药的长期使用，生态环境中DDT的积累也越来越多，动物、植物、水、土壤以及空气的样本中均发现了 DDT的残留，即使是在从没有该类农药使用纪录的南极，也发现了 DDT的存在，说明DDT的影响是全球性的。在人群的流行病学调查中发现，DDT在人体中的蓄积有可能是过去50年来肝癌、结肠癌以及乳腺癌等癌症发病率升高的原因之一。鉴于DDT对生态环境的巨大污染以及潜在的对人体健康的危害，从70年代开始，欧美等的发达国家相继禁止DDT的生产和使用。2001年5月21-23日，在瑞典斯德哥尔摩外交大会上通过《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》后，包括中国在内的世界上92个国家和欧共体在斯德哥尔摩签署了旨在控制和消除POPs及其污染影响的公约，从而全面开始了削减和淘汰POPs的国际合作，但在一些欠发达国家和地区，特别是在非洲国家，DDT作为切断疟疾传染途径的廉价而有效工具仍在使用。此外，DDT具有持久性、半衰期长(约为7年)和难降解的特性，且在生物体内具有累积性，在环境中仍大量存在，其残留量对人体健康具有严重损伤，因此，关于其和人类健康关系的研究，特别是和肝脏健康的相关性研究越来越受到人们的重视。[0003]维生素C又称抗坏血酸，是一种水溶性的天然抗氧化剂。维生素C的应用也比较广泛，它可以增强人体免疫`功能；预防和治疗缺铁性贫血；预防和治疗恶性贫血；预防和治疗坏血病；促进胶原形成和胆固醇的代谢；有利于维持骨骼和牙齿的正常功能；有利于维持细胞膜的完整性；具有抗衰老作用；具有防癌抗癌作用。此外，维生素C对某些毒性物质具有解毒作用，铅化物、砷化物、苯、细菌毒素等是日常膳食中常见的有毒有害物质，对人体健康存在潜在危害。当致毒剂量的铅化物、砷化物、苯以及细菌毒素等进人人体内时，充足的维生素C有利于缓解其毒性，从而降低这些有害物质对人体健康的危害程度。但是关于维生素C对于农药毒性的解毒作用，目前未见报道。[0004]经对现有文献的检索，未见关于维生素C在抑制DDT肝脏毒性中应用的报道。
[0005]本发明的目的在于提供维生素C的新用途，即维生素C在抑制农药DDT肝脏毒性中的应用。[0006]本发明是通过体外细胞实验，用DDT和维生素C单独或者共同处理人正常肝细胞HL-7702，检测该细胞生长的情况，30 μ M和60 μ M的DDT对人肝脏细胞的损伤分别为27.5%和46.4%，通过加入5-100 μ M维生素C后，减弱了该损伤，细胞凋亡率最大降低至2%，实验表明维生素C与DDT共同处理HL-7702细胞，可以显著抑制DDT对HL-7702细胞损伤，而维生素C单独处理细胞，对HL-7702细胞生长没有影响。说明维生素C可在抑制DDT肝脏毒性中的应用。[0007]维生素C传统上是作为一种水溶性的天然抗氧化剂，具有增强人体免疫功能；预防和治疗恶性贫血和坏血病；促进胶原形成和胆固醇的代谢；有利于维持骨骼和牙齿的正常功能和细胞膜的完整性；具有抗衰老和防癌抗癌等功能。本发明为维生素C提供了一种新用途，即维生素C在抑制农药DDT肝脏毒性中的应用。可使DDT高暴露地区、高残留地区人群重视维生素C的食用，服务于人类健康。也可以为农药DDT污染的环境治理提供理论依据。



[0008]图1经MTT方法检测，所得到的DDT对HL-7702细胞生长的影响
[0009]图2经MTT方法检测，所得到的维生素C对HL-7702细胞生长的影响
[0010]图3经MTT方法检测，所得到的维生素C与DDT共同处理，对HL-7702细胞生长的影响

[0011]实施例1:
[0012](一)农药DDT和维生素C单独处理或共同处理的剂量选择:
[0013](I)取0.176g维生素C粉末，加入IOml PBS缓冲液，置于4°C搅拌器上搅拌，在细胞超净台中，用0.22微米的微孔滤膜过滤。配成终浓度为IOOmM的维生素C溶液。
[0014](2)将(I)中得到的IOOmM的维生素C溶液，用培养细胞所用的培养基，稀释成不同的工作浓度，即 1、2、5、10、30、50、70、100μΜ。
[0015](3)在细胞超净台中，往0.1g DDT粉末中加入3.54ml DMS0，置于振荡仪上振荡。配成终浓度为IOOmM的DDT溶液。
[0016](4)将(3)得到IOOmM的DDT溶液，用培养细胞所用的培养基，稀释成不同浓度的工作浓度，即 1、5、10、20、30、40、50、60 μ Μ。
[0017](5)将(I)中获得的IOOmM的维生素C溶液，用(3)中稀释得到的30或60 μ M的DDT溶液，稀释成1、2、5、10、30、50、70、100μΜ的维生素C溶液。
[0018](二)农药DDT和维生素C单独处理或共同处理HL-7702细胞24小时后，对细胞生长的影响:
[0019]将处于对数生长期的HL-7702细胞，以I X IO3个/孔传入96孔培养板。37°C含5%的C02培养箱孵育24小时后，分别用维生素C和DDT单独或共同处理，设五个复孔。孵育24小时后弃去孔内培养基，用PBS洗涤2次后加入新的培养基，每孔加MTT溶液(5mg/ml)20ml，继续孵育4小时后终止培养。小心弃去孔内培养上清液，每孔加入150ml DMS0，摇床振荡lOmin，使结晶物充分溶解。于570`nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。
[0020]本发明用维生素C和DDT单独或共同处理，检测对人正常肝细胞株HL-7702细胞的生长影响，当DDT含量为1、5、10、20、30、40、50、60 μ M时，对HL-7702细胞生长的抑制，呈剂量依赖性的关系，且当含量大于10 μ M时，显著性地抑制了 HL-7702细胞的生长(ρ〈0.05)(见图1);当维生素C含量为1、2、5、10、30、50、70、10(^]?，处理1-7702细胞24小时后，对HL-7702细胞生长基本无影响(p>0.05)(见图2);当1、2、5、10、30、50 μ M的维生素C与30或60 μ M的DDT共同处理HL-7702细胞24小时后，维生素C减弱了 DDT对HL-7702细胞生长的抑制效果，且当维生素C含量大于2-50 μ M时，极显著地减弱DDT的肝脏毒性(ρ〈0.01)(见图3)。`