露那辛多肽在防治白内障药物中的应用的制作方法[0002]白内障是世界上居首位的致盲性眼病，也是严重危害我国人民身体健康的重要疾病之一。据统计，我国盲人中由白内障而致盲者占41.06%，低视力患者中49.38%为白内障所致。虽然白内障可以通过手术加以摘除，但手术后常会引发晶状体后囊膜浑浊(后发性白内障)等并发症，进而严重影响其治疗效果。因此，研制有效的白内障防治药物具有重要的实际应用价值。[0003]白内障发病机制较为复杂，是机体内外多重因素对晶状体长期综合作用的结果，这些因素包括紫外线照射、全身代谢性疾病、年龄、遗传等。氧化应激损伤学说认为，活性氧自由基(reactive oxygen species,R0S)引起的晶状体氧化损伤及生化改变是导致白内障的主要机制，即正常生理情况下机体产生的自由基受抗氧化防御系统的制约，而如果由于体内外因素发生变化而打破这种平衡，就会导致自由基局部浓度过高，进而对晶状体产生氧化损伤，如脂质过氧化作用、蛋白质交联和聚集、DNA损伤、细胞凋亡等，最终引发白内障。[0004]脂质过氧化主要是指氧自由基对晶状体细胞生物膜中所含的不饱和脂肪酸的攻击而产生的氧化作用，这种氧化作用会引起膜的流动性发生改变，通透性升高，细胞内外离子分布异常，从而导致晶状体浑浊。[0005]自由基对晶状体蛋白的作用，主要表现在引起蛋白结构的交联、聚合和肽链的断裂，也可使蛋白质和脂质结合形成聚合物，使蛋白质活性消失，它还可攻击蛋白分子中还原性巯基，从而严重破坏蛋白的生物活性。[0006]此外，自由基还可通过多种途径引起DNA损伤和对膜泵系统的破坏，而由氧化损伤诱导的晶状体上皮细胞(Lens epithelial cell, LEC)凋亡则是白内障形成的重要细胞学基础。[0007]虽然晶状体上皮细胞(LEC)在正常情况下存在一系列抗氧化酶及抗氧化蛋白，如超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)和谷胱甘肽S转移酶(GST)，以及抗氧化蛋白A0P2等，它们可以消除R0S，然而，如果这些酶活性降低则会导致白内障发生。因此，提高晶状体的抗氧化能力，抑制ROS的产生或清除ROS可以有效地防止或延缓白内障的发生或发展。
[0008]露那辛(Lunasin)是一种最初从大豆中分离得到的活性肽，由43个氨基酸残基组成，分子量为5KDa(J Biol Chem，1987，262 (22): 10502-10505)。现已有研究证明，露那辛具有抗肿瘤、抗炎症、抗氧化等药理活性(Protein Peptide Lett, 2013, 20 (4):424-432)。在抗氧化活性方面，露那辛具有较强的清除自由基功效，可显著抑制细胞内活性氧(ROS)的过量产生，从而保护细胞和组织免受氧化应激(Oxidative Stress)所带来的损伤(FoodChem Toxicol, 2013,65:155-161 ;Cancer Lett, 2010, 293 (I):58-64.)。露那辛多肽抗氧化作用明显，可大量减少体内产生的过多的活性氧(ROS)，因此，可应用于由于体内活性氧自由基(reactive oxygen species,R0S)产生过多而引起的疾病预防与治疗药物。白内障的发病机制与晶状体内活性氧(ROS)过量产生有着紧密的联系，而露那辛可以显著抑制体内活性氧自由基(reactive oxygen species, R0S)的过量产生。因此,露那辛可应用于预防和治疗白内障的药物。


[0009]本发明公开了多肽露那辛(Lunasin)多肽的一种新用途，即在预防和治疗白内障药物中的应用。
[0010]露那辛是一种最初从大豆中分离得到的活性肽，由43个氨基酸残基组成，露那辛除了具有抗肿瘤、抗炎症的药理活性之外，还可有效抑制细胞内活性氧(ROS)的产生，清除体内的自由基，具有很强的抗氧化应激的功能(Food Chem Toxicol，2013，65:155-161 ；Cancer Lett, 2010, 293 (I):58-64.)。由于白内障的发病机制与晶状体内活性氧自由基(ROS)的过量产生密切相关，而露那辛具有很强的抗氧化应激的功能，因此本发明将露那辛多肽应用于白内障防治药物。
[0011]本发明将露那辛多肽制成滴眼液，并在动物体内进行了抑制白内障药效学实验。实验动物选用3周龄的清洁级SD大鼠为研究对象，首先采用D-半乳糖溶液诱导的方法(按25ml / kg的剂量腹腔注射0.08%的D-半乳糖溶液，同时饮用10% D-半乳糖溶液)进行白内障造模，当晶状体中的空泡占晶状体前皮质面积的I / 3时，说明造模成功。然后对模型组、露那辛滴眼液组、苄达赖氨酸滴眼液(阳性药)组分别用露那辛滴眼液空白基质、露那辛滴眼液滴眼以及苄达赖氨酸滴眼液滴眼进行给药，连续给药30天后，结果表明露那辛滴眼液可以有效抑制D-半乳糖诱导的白内障。
[0012]本发明在细胞水平上的实验结果证明，露那辛能够保护人晶状体上皮细胞(Human lens epithelial cell line SRAOl / 04)免受高浓度 D-半乳糖对其损伤。通过Hoechst33342-Propidium iodide荧光双染色法证实，露那辛能够抑制250mM D-半乳糖诱导的人晶状体上皮细胞的凋亡。RT-PCR分析表明，Lunasin可显著增强经250mMD-半乳糖处理的人晶状体上皮细胞中重要的抗氧化酶(如超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase, S0D)、过氧化氧酶(Catalase, CAT)、谷胱;甘妝疏基转移酶(GlutathioneS-transferase,GST)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX1)、过氧化物酶(Peroxiredoxin6, Prdx6))等基因的表达。

[0013]下面结合实施例详细说明本发明，这些实施例只用于举例说明的目的，并不限制本发明的范围:
[0014]实施例1露那辛滴眼的制备
[0015]露那辛滴眼液配方:露那辛，0.04g ;透明质酸钠，0.1g;硼酸，1.116g;硼砂，
0.191g ;氯化钠,0.22g ;乙二胺四乙酸二钠,0.5g ;对羟基苯甲酸乙酯,0.03g。注射用水定容至100ml。
[0016] 露那辛滴眼制备工艺:[0017]1.在60_80°C的水浴条件下，快速搅拌并缓缓将0.1g透明质酸钠加入到70ml注射用水中，使其完全分散，充分溶胀，勿使粘结成团，搅拌30分钟左右即可完全溶解。
[0018]2分别将硼酸、硼砂、氯化钠、乙二胺四乙酸钠和对羟基苯甲酸乙酯加入到上述透明质酸钠溶液中，搅匀溶解，然后定容至100ml，即得pH7.4的滴眼液空白基质。
[0019]3.将露那辛冻干粉加入到上述滴眼液空白基质中，搅匀溶解，通过0.22 μ m滤器过滤除菌，然后分装，4°C冰箱中保存，即得终浓度为80 μ M的露那辛滴眼液。
[0020]实施例2露那辛对D-半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用
[0021]以人晶状体上皮细胞(Humanlens epithelial cell line SRAOl / 04,购自中国医学科学院肿瘤研究所)为研究对象，MTT法测细胞存活率。实验组共分为正常组(空白对照)，模型组(仅用250mM D-半乳糖处理细胞)，露那辛药物组(用250mM D-半乳糖和ΙμΜ，10 μ Μ，20 μ Μ，40 μ Μ，80 μ M的露那辛共同处理细胞)。对数生长期的人晶状体上皮细胞经0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)DMEM(Gibco)制备成细胞悬液，以5 X IO3细胞/孔接种于96孔板，每孔200 μ 1，待细胞贴壁生长,长至占孔底面积8 0%时候，将原培养基弃掉，PBS清洗一次，每孔加入200 μ I无血清DMEM。正常组加入PBSlO μ I做对照；模型组加入含D-半乳糖的PBSlO μ 1，加入后使半乳糖终浓度为250mM ;露那辛药物组加入含D-半乳糖和露那辛的PBSlO μ 1，加入后使半乳糖终浓度为 250mM，露那辛终浓度依次为 14]?，1(^]1，2(^]1，4(^]1，8(^]1，于371:，5% CO2培养箱中培养24小时。24小时后，每个实验孔加入20 μ I MTT (5mg / ml)，置于5% CO2培养箱中培养4小时，之后将孔内溶液弃掉，每孔加入150 μ I DMS0，振荡器振荡lOmin，酶联免疫检测仪测A57tlnmt5结果表明，与模型组相比，露那辛浓度达到ΙΟμΜ时就可以对人晶状体上皮细胞起到保护作用(*ρ〈0.05)，显著提高细胞存活率(见表1)。
[0022]表1露那辛对D-半乳糖损伤的人晶状体上皮细胞的保护作用SD, η=5)
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