专利名称：动物血液体外酶促降解提取胆红素的生产方法胆红素作为人工牛黄的主要成分，在医药中广泛得以利用。胆红 素的提取大多是从动物胆汁中提取的，但动物胆汁中胆红素的含量仅 为万分之一到三，且胆汁收集困难，容易氧化和腐败，使胆红素的收 率很低，不能满足医药上的需要。故人们另辟途径，以动物血液作原 料来提取胆红素。生物科学研究表明，动物血液中红细胞的主要成份 是血红蛋白，血红素是血红蛋白的辅基，血红素在其卟啉分子中心， 由卟啉中四个吡咯环上的氮原子与一个亚铁离子配位结合,再与珠蛋白肽链中第8位的一个组氨酸残基中的吲哚侧链上的氮原子从卟啉 分子平面的上方与亚铁离子配位结合，即是生物体内具有输氧功能的 血红蛋白。l个血红蛋白分子含有4个亚铁血红素辅基。血红蛋白在 体内分解时，血红素失去铁而被氧化，卟啉环打开生成胆绿素，再经 还原后生成胆红素。因此，在一定条件下，血红素可以和蛋白质分离， 这就是能够提取血红素、再由血红素生成胆红素的理论根据。为了模仿血红素在体内的分解和转化过程，人们开发了非酶促降 解和酶促降解血红蛋白及血红素制备胆红素的方法。不论是非酶促降 解还是酶促降解,首先都要对血液进行抗凝处理,然后分离除去血浆， 将得到的红细胞加蒸馏水或反复冻融，释放出血红蛋白，进行非酶促 降解或酶促降解反应，使血红素转化为胆红素，最后提取和精制胆红 素。如衡阳医学院学报1990年18巻第4期(409页)报导了 "应 用化学转化法由猪血制备胆红素"，即属于非酶促降解法。非酶促解3法工艺简单，所用的血红素氧化剂和胆绿素还原剂是化学试剂，比较 容易得到；但存在着分离困难这一明显不足，这是因为天然胆红素是 胆红素IXa，而用该法得到的胆红素是胆红素四种异构体IXa、 IxP 、 IXY、 IXS的混合物，故而很难分离纯化。所述的酶促降法是利用血红素加氧酶系,把血红蛋白或血红素降 解为胆绿素，再加入胆绿素还原酶，还原得到胆红素。如中国专利申 请93111477.2的"酶法合成胆红素"，它所用的血红素加氧酶系由血 红素加氧酶、胆绿素还原酶和NADPH-细胞色素C还原酶按1: 1: 1的摩尔比混合而成，其中NADPH是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (还原态)]。该法是模拟血红素在体内代谢的过程，因此，血红素 降解后得到的是胆绿素IXa，它不像非酶促降解法得到的是四种异构 体的混合物。但是，酶促降解法中所用的血红素加氧酶和胆绿素还原 酶，目前很难分离提取，这是因为血红素加氧酶是混合功能氧化酶， 存在于体内的网状皮系统细胞中，即肝、脾、骨髓或巨噬细胞等各细 胞的微粒部分，而胆绿素还原酶则存在于上述细胞的胞浆部分，分离 提取困难，工艺复杂、价格昂贵，不适于工业化生产。另外，从该专 利的整个工艺步骤上看，其过程也不够简捷、实用和合理。比如在 l步中，采用机械方式破碎红细胞，破碎率低；在2步的酶促降解反 应前，没有分离珠蛋白，而是在反应后的碱液环境下进行解离，并离 心分离，但珠蛋白在碱性环境中很难解离，反应后未分离的珠蛋白易 与后续胆红素提取与精制工序所用到氯仿液交融乳化，分离困难，从 而影响产品的品质。综上所述，非酶促降解法虽工艺简单、试剂易得，但从产品中分 离出天然胆红素IXa却十分困难；酶促降解法虽能够得到天然胆红 素，但所需的酶不易提取，工艺复杂，成本高，不适于工业化生产。

本发明的目的是针对已有技术的问题，提供一种改进的动物血液 体外酶促降解提取胆红素的生产方法，以求简化工艺过程、降低生产 成本，使其适于工业化生产。
4为实现上述目的，本发明的技术方案如下 本发明与已有技术相比的特点如下
一、 在血红素的提取中，直接调节酸性丙酮萃取液的PH值，使 血红素自然沉淀，抽滤得到的丙酮经酸化后可反复使用，既避免了蒸 馏回收丙酮带来的溶剂损失(一般损失为40%),还降低能耗和污染， 降低了生产成本，同时简化了工艺，提高了生产效率。
二、 本发明不用提取和纯化血红素加氧酶和胆绿素还原酶，而是 用收集动物新鲜肝脏和脾脏细胞液来建立血红素加氧酶和胆绿素还 原酶的反应系统，这一步的改进向工业化生产迈进了一大步，大大降 低了酶促降解法的工艺难度，使其简便易行，同时降低了生产成本， 提高了生产效率。
三、 本发明的工艺设计比较合理，特别是l步的设计，意在生物 转化前对血红素进行提取而分离出珠蛋白，不采用已有专利中用血红 蛋白直接进行生物转化的方法，从而使后续的分离提取变得简单，保 证了产品的品质。1步得到的血红素纯度均大于80%,可直接进入下
一步的生物转化，血红素的转化率为30 50%，已经达到了较高的转 化率，因此，在1步中不需要对血红素进一步提纯，使工艺过程进一 步简化。

实施例l
1、血红素的提取取新鲜牛血液1000克，经抗凝处理(抗凝处
理为已有成熟技术，可以用草酸盐、柠檬酸盐等作抗凝剂，加入新鲜 血液中)后，用血液分离机分离除去血浆，得到红细胞，将红细胞反
复冻融，使其破裂，然后用PH值为2 3的酸性丙酮作萃取剂萃取 血红素(酸性丙酮溶液通常是丙酮溶剂加酸,酸可以是盐酸或硫酸等, 占丙酮溶剂体积的1 3%。该制备为本领域公知技术)，则血红素溶 于萃取剂中，珠蛋白沉淀，过滤，除去珠蛋白沉淀物，再用碱液调节 滤液的PH值至5，则血红素自然沉淀，抽滤，得血红素，纯度84%， 滤液为丙酮溶剂，再加酸后，仍作为萃取剂重复使用。其中所述碱液可以是浓度为10 30%的NaOH、 KOH、 NaC03或NaHC03等的溶 液。本例用的是NaOH溶液。
2、 血红素的生物转化取新鲜或冷冻的牛肝脏和脾脏各1000 克用胶体磨磨碎，浆液经反复冻融，使细胞破裂，过滤除去有形物质， 得酶促降解液备用；用PH值为7.2的缓冲溶液溶解上步所得的血红 素5克,所述的缓冲溶液可以是浓度为10 30%磷酸盐或碳酸盐溶液； 将酶促降解液和血红素溶液按1: 30 50的体积比混合均匀，在37
t:下反应25 40分钟，加热到6or;io分钟终止反应，过滤，得粗品
胆红素和蛋白的共沉淀物23.7克。其中所述的蛋白是肝脏和脾脏中 的变性蛋白，它与胆红素不结合，故在下步中很容易分离。
3、 胆红素的提取和精制
在上步所得的粗品胆红素和蛋白的共沉淀物中加入10倍体积量 的三氯甲烷或二氯甲烷，在室温下缓慢搅拌1 2小时，静置，收集 上层有机溶剂，下层残渣按如上方法反复提取操作2次，收集有机溶 剂层，减压回收有机溶剂近干时，再加入残留液10倍体积量的乙醇 继续蒸馏，胆红素精品即析出。干燥后称重为1.72克，測定含量为 91.3%。
本例的血红素转化率为37.3%。 实施例2
1、 血红素的提取取新鲜牛血液1000克，经抗凝处理后，用血 液分离机分离除去血浆，得到红细胞，将红细胞反复冻融，使其破裂， 然后用PH值为2 3的酸性丙酮作萃取剂萃取血红素，过滤，除去 珠蛋白沉淀物，再用NaOH溶液调节滤液的PH值至4，则血红素自 然沉淀，抽滤，得血红素，纯度为86%，滤液加酸后，仍作为萃取 剂重复使用。
2、 血红素的生物转化取新鲜或冷冻的牛肝脏和脾脏各1000 克用胶体磨磨碎，浆液经反复冻融，使细胞破裂，过滤除去有形物质, 得酶促降解液备用；用PH值为6.8的缓冲溶液溶解上步所得的血红 素5克，将酶促降解液和血红素溶液按1:10 30的体积比混合均匀，
6在371C下反应40 60分钟，加热到60TC10分钟终止反应，得到粗 胆红素溶液，过滤得粗品胆红素和蛋白的共沉淀物25.8克。 3、胆红素的提取和精制
在将上步所得的粗品胆红素和蛋白的共沉淀物中加入10倍体积 量的三氯甲垸或二氯甲烷，在室温下缓慢搅拌1 2小时，静置，下 层残渣按如上方法反复提取操作3次，收集有机溶剂层，减压回收有 机溶剂近干时，再加入残留液10倍体积量的乙醇继续蒸馏，胆红素 精品即析出。干燥后称重为1,92克，测定含量为93.5%。
本例血红素的转化率为41.7%。


本发明是一种动物血液体外酶促降解提取胆红素的生产方法。它包括血红素的提取、血红素的生物转化和胆红素的提取与精制三大步骤。本发明重大的改进点是在血红素的生物转化中不用提取和纯化血红素加氧酶和胆绿素还原酶，而是用收集动物新鲜肝脏和脾脏细胞液来建立血红素加氧酶和胆绿素还原酶的反应系统，大大降低了已有酶促降解法的工艺难度，使其向工业化生产迈进了一大步。另外，在酸性丙酮萃取血红素中，本发明用直接调节萃取液的pH值，使血红素自然沉淀，抽滤得到的丙酮可反复使用，避免了蒸馏回收丙酮带来的溶剂损失，降低能耗和污染。本发明还具有工艺步骤设计合理、简便易行、血红素转化率高、产品品质好等优点。