专利名称：一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法我国是一个农业大国，畜牧业是我国农业的重要组成部分，畜牧业在国民经济中占有举足轻重的地位。据统计，2010年畜牧业收入的增长速度已超过种植业，成为农民收入的主要来源之一。大力发展畜牧业仍然是我国农业产业结构调整、农业和农村经济发展以及农民增收的重点。养羊业是我国畜牧业的传统产业，细毛羊在我国养羊业中占重要位置，细毛羊是兵团畜牧业的主要畜种，也是兵团畜牧经济中最具特色和代表性的优势产业。我国人口众多，又是世界服装出口大国，细毛羊业的发展与我国畜牧业和纺织业的经济效益和市场竞争力密切相关，影响着区域经济的发展和社会稳定。培育成功的中国美利奴细毛羊享誉国内外。细毛羊业的发展为优化兵团农业结构，促进毛纺工业发展，提高畜牧业整体效益，以及加快养羊良种化进程都做出了重大贡献。我国是世界上消耗羊毛最多的国家，羊毛的自给率仅为1/3，供求缺口很大，每年需要从国外进口大批细羊毛，总价值达到60亿美元左右，其中大部分是细绵羊毛和超细绵羊毛。近年来，随着毛纺产品向自然、舒适、轻薄、柔软的方向发展，世界羊毛品质也出现了划时代的变革，主要表现在羊毛细度上。中国对进口羊毛品质和细度的要求越来越高，我国和澳大利亚双边羊毛贸易的品质结构以羊毛细度作为标准，羊毛细度是体现加工价值的一个重要的指标，过去毛纺部门需求毛细度以60 64支为主，近年来66 70支羊毛的需求不断增加，羊毛越细，加工附加值越高。中国美利奴羊(新疆军垦型)的培育从1972年开始，刘守仁等在新疆生产建设兵团协作组以紫泥泉种羊场为育种场在短期内通过级进杂交方法成功培育中国美利奴羊(新疆军垦型)。分为六个品系，分别为军垦A型品系、军垦B型品系、超细型品系、肉用多胎品系、 毛用多胎品系、U品系。A品系具有体格大，产毛量高，毛密的特点。B品系具有毛长，羊毛品质好的特点。超细毛品系具有毛细的特点，主体细度达到15 18 μ m (80 90支)。肉用多胎品系兼具肉品质好和繁殖率高的特点。毛用多胎品系兼具毛品质好和繁殖率高的特点。截止2002年已向全国23个省、自治区推广优质种羊12万只，为我国细毛羊事业的发展和改良工作做出了重大贡献。但是，如何进一步提高羊毛细度，培育超细毛种羊，以及快速扩大种群规模仍然是一个重要问题。分子标记技术能够在种羊选育中避免年龄、性别、环境的干扰，实现早期、快速、准确的选择优质细毛羊，组建并扩大优质细毛羊种群。因此，寻找羊毛细度(毛纤维直径)相关基因及分子标记，应用现代分子育种新技术快速培育超细毛羊、快速扩大优质细毛羊种质规模势在必行。研究表明，羊毛纤维的复杂结构主要由角蛋白家族组成。这些蛋白对于羊毛纤维的机械性能和主要构造起主要作用。羊毛纤维主要由三部分组成角质层、皮质层和一少部分有髓粗毛组成。羊毛纤维的90%由皮质层组成，皮质层由嵌入角蛋白关联蛋白-KAPs 里面的丝状的微纤维组成。微纤维包括角蛋白中间丝蛋白，而角蛋白中间丝蛋白是我们已知的“硬” a -角蛋白。这些角蛋白是低硫蛋白，由两个蛋白家族构成，分别是I型角蛋白和II型角蛋白。根据氨基酸组成，KAPs分成三类高硫角蛋白关联蛋白(KAP1. η、ΚΑΡ2. η、 ΚΑΡ3. η)，超高硫角蛋白关联蛋白(ΚΑΡ4. η、ΚΑΡ5. ικΚΑΡΙΟ. η)和高甘氨酸-酪氨酸角蛋白关联蛋白(ΚΑΡ6. η、ΚΑΡ7. η、ΚΑΡ8. η)。KAP基因大多为小片段，大小一般在0. 6Kb 1. 5Kb之间，并且都不含内含子。在羊毛纤维蛋白中有很多变异，尤其对于基质蛋白，尽管在数千年针对羊毛纤维的品质选育中，变异逐渐减少，但是，毛纤维异质性仍然存在。很多研究报道角蛋白和KAP 基因家族存在多态性。角蛋白及亚家族编码基因存在多个插入/缺失和单核苷酸(SNP) 突变，这些基因多样性与羊毛性状(细度、强度、弹性和弯曲度等)存在相关关系(管峰等， 2007)。羊毛细度是一个高遗传力性状，达到0. 59，但在不同绵羊品种间略有差异(Safari 等，2007)，同时羊毛纤维的细度是一个复杂的调控过程，受到多种影响因素的调控和制约， 与体重、体脂含量、繁殖率等也存在相互制约关系。最近在KAP1. 1、KAP1.3基因编码区发现了多个SNP位点，但是和羊毛性状之间的关系尚需进一步研究(Itenge-Mweza等，2007)。刘桂芬等(2005)用微卫星标记对新疆优质细毛羊进行专门的遗传多样性及羊毛细度候选基因进行分析，选择21号染色体上高硫蛋白家族中KAP1. UKAP1. 3中的部分序列和1号染色体高甘氨酸一酪氨酸蛋白KAP6. 1的外显子进行研究，结果发现KAP1. 1、KAP1. 3所在区域中位点W08667与羊毛细度相关(P<0. 05)。张亚妮等研究了 KAP基因与内蒙古绒山羊经济性状的关系得出KAP基因的部分位点与绒细度存在相关。
本发明的目的在于提供一种操作简单、成本低、精确度高的采用PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测绵羊毛纤维直径，从而预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法。本发明通过以下技术方案实现一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，其特征主要包括以下步骤 (1)根据绵羊KAP1. 1基因序列设计一对引物 KFl: <210>1 ； KRl: <210>2。(2)从绵羊血液中提取基因组DNA，利用该引物对绵羊的基因组DNA进行PCR扩增；(3)使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出KAP1.1基因外显子中的 60bp和30bp插入/缺失的变异位点；(4)多态性分析当绵羊KAP1.1基因外显子缺失60bp时，PCR扩增片段长度为^lbp, 将其命名为CC基因型；当绵羊KAP1. 1基因外显子缺失30bp时，PCR扩增片段长度为311bp， 将其命名为BB基因型；当绵羊KAP1. 1基因外显子含有60bp和30bp插入时，PCR扩增片段长度为341bp，将其命名为AA基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带，分别为 341bp和311bp，将其命名为AB基因型；341bp和281bp，将其命名为AC基因型；311bp和5^lbp,将其命名为BC基因型。实验证明具有BB基因型绵羊的平均毛纤维直径显著小于具有AA、BC、AC、AB和CC 基因型绵羊的平均毛纤维直径(P<0. 05)。其中用于分析多态性的位点选自绵羊KAP1. 1基因如下序列中的60个和30个碱基的插入/缺失，
1 caaccctcct ctcaacccaa ctcctgacac catggcctgc tgttccacca gcttctgtgg 61 atttcccatc tgttccactg gtgggacctg tggctccagt ccctgccagc agacctgctg 121 ccagaccagc tgctgccagc caacctccat ccagaccagc tgctgccagc caacttccat 181 ccagaccagc tgctgccaac cga(tctccat ccagaccagc tgctgccagc caa)cctccat 241 ccagaccagc tgctgccagc caacctgcct ccagaccagt ggctgtgaga cgggctgtgg 301 cattggtggc agcattggct atggccaggt gggtagcagc g，
以上序列下划线部分为60个碱基的插入/缺失，单划线部分为30个碱基的插入/缺失。其中分析基因多态性的方法是通过检测碱基的插入/缺失而分类的基因型，其中用于分析基因多态性的部位是外显子。而且是由KFl和KRl表示的引物扩增的部分外显子区。其中用于聚丙烯酰胺凝胶电泳的丙烯酰胺凝胶浓度为1 或14%任一种均可。所述的PCR扩增退火温度最好为65°C。其中绵羊毛纤维直径是绵羊的毛细度。本发明巧妙地采用PCR扩增和凝胶分离的方法检测绵羊KAP1. 1基因外显子中的 60bp和30bp插入/缺失的变异位点。由于AA基因型和BB基因型的KAP1. 1基因片段长度仅差30个碱基，由于BB基因型和CC基因型的KAP1. 1基因片段长度也仅差30个碱基，使用琼脂糖凝胶电泳很难将两种基因型分离，因此本发明采用1 或14%的聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离六种基因型。按照以下步骤
从绵羊血液中提取基因组DNA，应用KFl和KRl引物进行PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，根据条带进行基因型判定，并根据基因型，与绵羊毛纤维直径进行关联分析的应用。与现有技术相比，本发明的优点本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。使用本发明的标记基因型对绵羊的毛纤维直径进行选择时，将使绵羊毛纤维直径取得很大的遗传进展。利用本发明的分子标记方法对毛纤维直径进行选择，不仅为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为绵羊的细度性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速优质细毛羊的育种进程。


图1 是本发明的技术流程图。图2 绵羊KAP1. 1基因PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中聚丙烯酰胺凝胶浓度为14%。M泳道pUC 19DNA/Msp (HapII)Marker ；泳道 1 :CC基因型个体；泳道2、3 :AB基因型个体；泳道4、5、12、13 :BC基因型个体；泳道6、7、8、 9、10 :BB基因型个体；泳道11、14 4(基因型个体；泳道15、16 44基因型个体。箭头所指为331bp的条带。
图3 为3个分子标记在群体中不同基因型展示图。其中，A为AA基因型位点，B 为BB基因型位点，C为CC基因型位点。

1、样品采集和性状测定
采用一次性注射器从绵羊颈静脉抽取约Iml的血液，注入经高压灭菌并装有约200μ1 2% 无菌 EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝齐[J的 L 5ml 离心管中，轻轻摇勻，记录羊号，-20°C保存备用。采集绵羊体侧部皮肤毛样，根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织(IWTO)纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行细度、卷曲度、细度离散、自然长度、污毛量、密度、净毛率的测定。2、药品和酶
三羟甲基氨基甲烷(Tris)，Sigma Chemicals Co ;Tris饱和酚，北京鼎国生物技术发展中心；蛋白酶 K (Proteinase K),MERCK Co ；dNTP (dATP; dTTP; dCTP; (IGTP)Jaq 酶(配套 IOXTaq buffer, 25 讓ol / L Mg2+ )，大连宝生物公司；琼脂糖(Agarose H)、pUC19DNA / Msp (Hap II) Marker、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺，生工生物(上海)有限公司。3、主要仪器
Icycler PCR 仪(Bio-fcid 公司)、梯度 PCR 仪(Eppendorf 公司)、Gel2000 凝胶成像系统、Ultrospec 1000紫外分光光度计、Sigma 3K30高速冷冻离心机、Milli-Q超纯水仪、 Bio-Rad稳压电泳仪及配套电泳槽。二、实验方法
1、缓冲液与常用试剂的配制
TE 缓冲液=IOmM Tris · Cl，ImM EDTA，pH8. O，高压灭菌。20 X SET 缓冲液3M NaCl, IM Tris .Cl CpH 8.0)，20mM EDTA (pH 8.0)，高压灭菌。5XTBE 缓冲液54g Tris 碱，27. 5g 硼酸，20ml 0. 5M EDTA (pH8. 0)，加水至 1L。50XTAE 缓冲液242g Tris 碱，57. Iml 冰乙酸，100ml 0. 5M EDTA (pH8. 0)，加水至IL0IM Tris · Cl :121. 14g iTris碱溶于800ml双蒸水中，用盐酸调pH值至8. 0，定容至1000ml，高压灭菌。0.5M EDTA :186. Ig EDTA 溶于 800ml 双蒸水中，用 NaOH 调 pH 值至 8. 0，定容至 1000ml，高压灭菌。3M NaAc (pH5. 2) :408. Ig NaAc · 3H20 溶于 800ml 双蒸水中，用冰乙酸调 pH 至 7. 0，定容至 IOOOml0200ml 银染液=NH3 · H2O 2ml ； 3. 6% NaOH 4. 2ml ；20% AgNO3 3. 6ml，加去离子水至 200ml。200ml显色液1%柠檬酸钠Iml ；甲醛IOOul ；加去离子水至200ml。
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血细胞裂解液:10mMTris · Cl (ρΗ8· 0),0. IM EDTA (ρΗ8· 0),0. 5% SDS。2、引物的设计与合成
根据KAP1. 1基因序列(GenBank登录号AY835603)设计上游引物KFl和下游引物KR1， 引物由生工生物(上海)有限公司合成 KFl: <210>1 ； KRl: <210>2。3、绵羊基因组DNA的小量提取
(1)取20 μ 1抗凝血液，加入500 μ 1血细胞裂解液，加入蛋白酶K至终浓度为100-200 μ g/ml，混勻55°C消化l ir，直至溶液中不再有粘稠的团块。(2)将溶液冷却至室温，加入5M NaCl至终浓度1. 5 M，混勻lOmin。加入等体积酚/氯仿，反复颠倒离心管混勻lOmin。豊
(3) 12,000 rpm，室温离心lOmin。取上清，加等体积氯仿混勻IOmin0(4) 12,000 rpm,室温离心lOmin。取上清2倍体积无水乙醇沉淀DNA。(5)将DNA挑出放到1. 5ml离心管中，用70%乙醇洗1次。豊 (6)7，500 rpm,室温离心5min,弃上清。(7)将DNA干燥后(注意不能太干)溶于200 μ 1 TE中。4、PCR 反应
(1)以绵羊基因组DNA为模板进行PCR扩增，25 μ 1反应体系中包含以下溶液或试剂
IOXPCR reaction buffer2. 5 μ 1
dNTP Mixture (各 2. 5mM)2. O μ 1
引物 1 (10 μ Μ)0. 5μ 1
引物 2 (10 μ Μ)0. 5μ 1
EX-Taq (5U/μ 1)0.25 μ 1
去离子水18. 25 μ 1
基因组 DNA (50ng/y 1)1. Ομ 1
(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。94°C变性5 min;94°C 30 sec，65°C 30 sec，72°C 30 sec，33个循环；72°C延伸 5 min。(3)反应结束后，取PCR反应液(5 10 μ 1)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。5、非变性聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳
以浓度为14%、体积为25ml，厚度为0. Icm的胶为例。(1)清洗制胶用的玻璃板并用蒸馏水冲洗干净，烘干后，用0.8%琼脂糖封闭玻璃板和胶条间的缝隙。(2)在 IOOml 烧杯内加入 30% 丙烯酰胺 11. 7ml, 50% 甘油 2. 5ml, 5XTBE 5ml, 10% 过硫酸铵0. 175ml, TEMED 8 μ 1，去离子水5. 617ml，混勻后迅速灌胶。(3)当浇灌至离玻璃板上沿0. Icm时停止灌胶，插入梳子，室温聚和半小时，多余的丙烯酰胺4°C保存。随时观察凝胶聚合情况，并补加丙烯酰胺。(4)凝胶聚合好后，向电泳槽加入IXTBE，用注射器冲洗加样孔。(5)预电泳lOmin，同时准备点样。(6)取2 μ 1 PCR产物置于PCR管中，加2 μ 1上样Buffer混勻，用微量注射器点样。
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(7) 120V，电泳 8 10h。6、硝酸银染色方法
(1)电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶，置于70%乙醇中，水浴震荡器缓慢摇勻固定l(Tl5min。(2)双蒸水洗胶2遍，每次2min，去除残留乙醇。(3 )用 200ml 染色液染色 30min。(4)双蒸水洗胶3遍，每次anin。(5)用200ml显色液显色，约l(T30min，当DNA带的强度合适时，倒掉显色液。(6)去离子水洗掉多余的显色液，保鲜膜封好，扫描照相或保存。7、基因型判定
经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，KAP1. 1基因在绵羊群体存在六种基因型，对于 PCR扩增片段长度为观让？，将其命名为CC基因型；对于PCR扩增片段长度为311bp，将其命名为BB基因型；对于PCR扩增片段长度为341bp，将其命名为AA基因型；该位点杂合的个体PCR扩增产物为两条带，分别为341bp和31 lbp，将其命名为AB基因型；341bp和^lbp, 将其命名为AC基因型；31让？和^lbp,将其命名为BC基因型。(附图)。8、统计模型建立
根据中国美利奴羊品系选育的特点，构建线性统计模型如下 Yijkm= μ + Gi+ L , AJGiXLj+ GiXAffl + LjXAffl + e
其中为性状观察值，μ为群体性状均值，G i为基因型固定效应，L j为品系固定效应，Am为年龄效应。GiXLj为基因型和品系互作效应，GiXAm为基因型和年龄互作效应， LjXAm为品系和年龄互作效应，e为随机误差。使用统计软件JMP 4.0 (SAS Institute Inc.，Cary, NC, 2000)检验基因型与性状间的相关程度，并估计性状的最小二乘均值。本实施例是运用本发明的分子标记选择方法在中国美利奴(新疆军垦型)5个品系群体羊毛细度性状的选择应用。具体为选用中国美利奴羊(新疆军垦型)5个品系，共计768只，其中超细型品系 158只，毛用多胎型品系138只，军垦A型品系167只，军垦B型品系163只，肉用多胎型品系142只。采集绵羊颈静脉血液样本，_20°C保存备用。同时采集绵羊体侧部皮肤毛样，根据国家纤维检验标准并参考国际羊毛组织 (IWTO)纤维检测标准，对绵羊体侧部毛样进行自然长度、细度、细度离散、卷曲度、污毛量、 净毛率、密度的测定，按照细毛羊鉴定标准测定生产性能。其中，羊毛的细度和卷曲度在农业部种羊及羊毛羊绒质量监督检验测试中心(乌鲁木齐)检测。利用本发明的引物(KFl和KRl)对中国美利奴(新疆军垦型)群体768个个体的基因组DNA进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。KAP1. 1基因的PCR产物经电泳分离得到6种基因型，分别为AA基因型、AB基因型、AC基因型、BB基因型、BC基因型、CC基因型。对KAP1. 1基因60bp和30bp插入/缺失的变异位点的6种基因型在中国美利奴(新疆军垦型)5个品系群体中的分布进行分析， 结果表明BB基因型个体最多，基因型频率为0348。(表1)
表1 KAP1. 1基因插入/缺失位点不同基因型在绵羊群体中的分布单位只
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本发明公开了一种预示和鉴定绵羊毛纤维直径的分子标记选择方法，主要包括以下步骤根据绵羊KAP1.1基因序列设计一对引物；从绵羊血液中提取基因组DNA，利用该引物对绵羊的基因组DNA进行PCR扩增；使用聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳分离，检测出KAP1.1基因外显子中的60bp和30bp插入/缺失的变异位点；多态性分析。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行自动化检测。利用本发明不仅为绵羊育种工作中标记辅助选择提供了一个更为有效、简便易行的分子标记方法，同时为绵羊的细度性状改良提供了一种有效的分子标记育种手段，可以加速优质细毛羊的育种进程。