专利名称：结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的表达纯化及与磷酸复合体的晶体三维结构的制作方法结核分枝杆菌的全球控制当今面临着重大挑战，WHO报道，目前世界上二十多亿人口已感染结核分枝杆菌，造成每年近200万人口死亡。尤其是非洲等出现的结核分枝杆菌和艾滋病毒的合并感染(结核/艾滋病毒)增加了结核分枝杆菌的易感人群，以及在所有区域出现的耐多药(MDR)和广泛耐药(XDR)结核病，使疾病控制活动更趋复杂、更为艰巨。目前抗结核药物主要针对活性结核分枝杆菌，通过抑制其细胞壁，能量ATP和DNA的合成，针对休眠期的药物靶点研究甚少。目前认为，结核分枝杆菌细胞壁中的海藻糖是保护结核分枝杆菌度过干旱，炎热，缺氧等极端环境的必需二糖。Mladen Tzvetkov等人在2003年发表文章认为结核分枝杆菌体内有三条途径合成海藻糖，通过对每个途径中关键酶的基因敲出实验证明OtsAB通路(将葡萄糖和葡萄糖六磷酸转化为海藻糖)是海藻糖合成的至关重要的途径，对于结核分枝杆菌的生存具有不可缺失性，并且被证明存在于多种细菌、酵母、真菌、昆虫和植物中。在这条通路中参与合成海藻糖的酶有两种，一种是海藻糖-憐酸合成酶(trehalose-phosphatesynthase, TPS or OtsA)另一种是海藻糖-憐酸憐酸酶(trehalose-phosphatephosphatase, TPP or OtsB)。OtsA 主要用来催化将 UDP-葡萄糖中的葡萄糖基团转移到葡萄糖-6-磷酸中，产生海藻糖-6-磷酸和UDP，OtsB的功能是将磷酸基团脱去产生海藻糖。在OtsB基因的同源片段中，只有沉成2具有生理功能。OtsB2即海藻糖-6-磷酸磷酸酶，被证明对于结核分枝杆菌的生长不可缺失，并且在哺乳动物和人中不存在同源基因，是一种 理想的药物靶点。目前通过解析靶点蛋白质结构，可以对开展针对性的药物设计有重要帮助，因此揭示结核杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2对展开药物设计以及功能研究具有重价值。另夕卜，以往研究中结核杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2未见报导在细菌中获得表达纯化和结晶，能够获得细菌表达纯化的蛋白结晶对进一步研究海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的功能以及开展药物筛选工作具有重要帮助，可以大大节约时间以及大大降低工作成本和劳动强度。
本发明涉及结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的表达、纯化和结晶优化方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2硒代蛋白质的载体构建、表达和纯化方法，具体地说就是将29位和133位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，在大肠杆菌B121 (DE3)中使用特殊培养基大量表达硒代蛋白OtsB2 ；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体的结晶方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选及药物设计方面的应用。第一方面,本发明提供了一种在原核表达体系中，构建可溶性表达载体的方法。其中所述标签蛋白选自His、GST、Flag-tag、Mys-tag、MBP-tag、特异性抗体,优选地使用His标签，其他标签均不能得到可溶性表达蛋白；所述载体含有卡那霉素选择性标记基因。本发明优选使用大肠杆菌的原核表达体系(但不排除其他的表达系统，如在其他细菌中或者使用其他的真核生物细胞进行表达)对目的蛋白以His融合蛋白的方式进行表达。第二方面，本发明提供了表达和纯化结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的方法，该方法包括:构建融合了标签蛋白基因的编码结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2基因序列的载体，用该载体转化原核或真核细胞，从而表达带有标签蛋白的海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2 ;将上述获得的蛋白通过特异性的与所述特异标签识别的方法分离出所述目的蛋白，经过 Thrombin蛋白酶在4_30摄氏度透析酶切过夜,然后将蛋白经过ResourceQ离子交换层析(GE),反挂N1-NTA亲和层析柱,进一步用凝胶排阻层析(GE)等方法分离纯化OtsB2蛋白；用凝胶电泳的方法确定蛋白质的纯度。优选地，其中透析酶切温度为4-30摄氏度，优选地使用4-10摄氏度，透析缓冲液优选地使用 20-50mMTris (pH8.0)，IOOmMNaCl, ImMDTT ( 二硫苏糖醇)。优选地，其中反挂N1-NTA亲和层析柱优选地补充加入NaCl至终浓度300_500Mm，优选地使用浓缩换缓冲液除去二硫苏糖醇。第三方面，本发明提供了一种结晶上述得到的OtsB2蛋白的方法，所述的方法包括:将OtsB2蛋白溶液补加DTT至10禮，再浓缩至10-20mg/V，在4_30摄氏度下用气相扩散法筛选晶体生长条件。第四方面，本发明提供了一系列晶体优化的方法，包括:分别在在4、16和25摄氏度下，使用Hampton商业试剂盒中的所有条件进行初筛晶体,优选地使用16摄氏度；把长出晶体的池液与Hampton商业试剂盒中每个池液以16:1 1:1的方法混合,优选地使用4: I的方法进行混合，进行再次筛选和优化已有晶体，得到较优质的晶体；通过seeding的方法对蛋白晶体进行优化筛选，优选地，把新点好的平板平衡l_48h后进行seeding实验，更优选地平衡时间10-14h，就得到优质的晶体。第五方面，本发明提供了衍射性能良好的OtsB2蛋白质晶体。第六方面，本发明提供了 OtsB2硒代蛋白质载体构建的方法，具体是将OtsB2中的亮氨酸突变为甲硫氨酸，增加硒代蛋白质中硒原子信号，提供了一种可以得到海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2的晶体三维结构的方法。优选地，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2中突变的亮氨酸包括29位，133位，172位，285位和379位5个位点，更优选地是29位和133位的亮氨酸突变甲硫氨酸。第七方面，本发明提供了得到结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2和磷酸根复合体晶体三维结构的方法，通过筛选生长成型的OtsB2晶体，在晶体中加入底物海藻糖-6-磷酸进行孵育，底物海藻糖-6-磷酸的浓度优选地使用lO-lOOmM，更优选地使用50mM，孵育时间优选地使用6-24h，更优选地使用10_12h。第八方面，本发明提供了海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的三维结构，该结构描述了海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的二级结构组成、肽链走向、组织模式以及三维分子构造。其中针对海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的晶体进行X射线晶体衍射，得到上述两种晶体的晶体衍射数据，用所述的蛋白质晶体的衍射数据进一步通过结构解析，构建内海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的三维结构。在一具体的实施方式中，提供了海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白与磷酸根复合体的三维结构，其中所述的晶体三维结构中的原子具有表一中所列的至少一部分的原子坐标、或者任何与该坐标中至少40 %的氨基酸残基的主链碳骨架原子三维坐标的平均根方差(average root mean squaredeviation (RMSD))小于或等于1.7埃的结构。优选地，其中所述的海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2蛋白晶体具有P2 (I) 2 (I) 2 (I)的空间群，晶胞参数为约:a = 42埃，b = 89埃，c = 105埃，α = β = y = 90°。在一中，海藻糖-6-磷酸磷酸酶OTSB2在整体上分为两个结构域。其中N端结构域包括β折叠1，即包含从第-2位的Asp到第I位的Val的氨基酸区段，β折叠2，即包含从第16位的Ala到第20位的Asp的氨基酸区段，α螺旋1，即包含从第27位Gln到第37位Val的氨基酸区段，β折叠3，即包含从第39位的Gly到第43位的Phe的氨基酸区段，α螺旋2，即包含从第50位Ρι.ο到第57位Leu的氨基酸区段，β折叠4，即包含从第64位的Cys到第68位的Ser的氨基酸区段，α螺旋3，即包含从第71位Ser到第80位Ser的氨基酸区段，β折叠5，即包含从第84位的Leu到第88位的Val的氨基酸区段，α螺旋4，即包含从第94位Arg到第100位Asp的氨基酸区段，β折叠6，即包含从第104位的Thr到第108位的Val的氨基酸区段，α螺旋5，即包含从第109位Leu到第111位Glu的氨基酸区段，β折叠7，即包含从第112位的Val到第116位的Thr的氨基酸区段。其中由β折叠3，β折叠4，β折叠5，β折叠6，β折叠7组成的平行的β片层组成了 N端结构域的中心骨架，β折叠1，β折叠2组成的小的平行的β片层在一侧垂直于这个中心骨架。其中α螺旋1，α螺旋5与β折叠I, β折叠2组成的小的平行的β片层在这个中心骨架的一侧，α螺旋2，α螺旋3，α螺旋4，在这个中心骨架的另一侧。其中C端结构域包括α螺旋6，即包含从第121位的Met到第123位的Gln的氨基酸区段，α螺旋7，即包含从第127位的Ala到第132位的Gly的氨基酸区段，β折叠8，即包含从第141位的Gln到第147位的Asp的氨基酸区段，α螺旋8，即包含从第168位的Ala到第178位的Arg的氨基酸区段，β折叠9，即包含从第181位的Ile到第184位的Leu的氨基酸区段，α螺旋9，即包含从第189位的Leu到第195位的Arg的氨基酸区段，β折叠10，即包含从第202位的Trp到第205位的Gly的氨基酸区段，β折叠11，即包含从第210位的Glu到第213位的Ala的氨基酸区段，β折叠12，即包含从第216位的Gly到第220位的Gln的氨基酸区段，α螺旋10，即包含从第222位的Asp到第243位的Gly的氨基酸区段，β折叠13，即包含从第249位的Val到第253位的Lys的氨基酸区段，β折叠14，即包含从第256位的Gly到第260位的His的氨基酸区段，α螺旋11，即包含从第267位的Asp到第283位的His的氨基酸区段，β折叠15，即包含从第287位的Val到第289位的Thr的氨基酸区段，β折叠16，即包含从第294位的Ile到第296位的Leu的氨基酸区段，α螺旋12，即包含从第305位的Gly到第314位的His的氨基酸区段，β折叠17，即包含从第324位的Val到第329位的Gly的氨基酸区段，α螺旋13，即包含从第332位的Ile到第341位的Val的氨基酸区段，β折叠18，即包含从第346位的Val到第350位的Val的氨基酸区段，β折叠19，即包含从第364位的Phe到第366位的Leu的氨基酸区段，α螺旋14，即包含从第369位的Ρι.ο到第383位的Leu的氨基酸区段。其中β折叠8，β折叠9，β折叠10，β折叠11，β折叠12，β折叠17，β折叠18和β折叠19组成了反平行的β的片层，构成了 C端结构域的核心骨架结构，β折叠13, β折叠14, β折叠15和β折叠16组成了反平行的β的片层，构成了 C端结构域的另一个小的核心骨架结构。其中这两个由反平行的β的片层构成的核心骨架结构近似于相互平行。其中α螺旋10和α螺旋11分布在β折叠13，β折叠14，β折叠15和β折叠16组成了反平行的β的片层的一侧，但位于远离于β折叠8，β折叠9，β折叠10，β折叠11，β折叠12，β折叠17，β折叠18和β折叠19组成了反平行的β的片层的方向上。在β折叠8，β折叠9，β折叠10，β折叠11，β折叠12，β折叠17，β折叠18和β折叠19组成了反平行的β的片层的两侧，一边上分布着α螺旋12和α螺旋13，另一边分布着α螺旋7，α螺旋8，α螺旋9和α螺旋14，由此组成了典型的α β α的结构。优选地，其中所述海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2中结合有一个镁离子，由Aspl47，Asp330, Asp331构成的酶活中心。海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2蛋白与磷酸结合的复合体结构与海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2蛋白结构大体上保持一致，磷酸根通过与镁离子形成配位键结合在活性中心。海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2蛋白与磷酸结合的复合体结构中，镁离子参与的活性中心氨基酸残基发生改变，结合磷酸前分别是Asp 147、Gly 150、Asp330和Asp331，结合后Glyl50变为D149位，镁离子与活性中心氨基酸残基的距离也变近了。具体而言，镁离子通过与4个天冬氨酸，一个水分子和磷酸根形成6个配位键。优选地，在海 藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的活性中心通过镁离子结合的是磷酸根。第九方面，本发明提供了结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的晶体三维结构在设计和筛选用于治疗结核分枝杆菌感染引起的疾病的各种多肽，蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物中的应用，包括:根据蛋白质三维结构坐标，通过计算机模拟来设计结合在海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2S性口袋的多肽、蛋白质、无机或有机化合物、抗体或免疫结合物分子。图1为基于来自四种不同种属的海藻糖-6-磷酸磷酸酶的蛋白质序列的比对。四种原核细菌分别是结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、胞内分枝杆菌和嗜酸热原体，这一结果表明不同种属的海藻糖-6-磷酸磷酸酶在碳端酶活中结构域具有高度保守的氨基酸残基，但是在氮端保守性较差。其中 M.tuberculosis、M.lepraeTN、M.1ntracellulare 和Τ.acidophilum分别是结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、胞内分枝杆菌和嗜酸热原体，图中用...表示在相应的区段的氨基酸缺失，在说明书以及权力要求书中具体的氨基酸位置均是以M.tuberculosis为例说明的。图2为结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2及其与磷酸根复合体的三维结构图。其中(A)为结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶0tsB2与磷酸根复合体的结构飘带图的俯视图，其中β折叠用紫色显示，α螺旋用蓝色显示，镁离子用粉色显示，水分子用浅蓝色显示，其中黑色框中为磷酸根与镁离子以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2相互作用区域，在说明书以及权力要求书中具体的氨基酸位置均是以(A)为例说明的。(B)为结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶沉成2与磷酸根复合体侧视图，具体为(A)图沿Y轴旋转45°。(C)为磷酸根与镁离子以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2之间的相互作用图解。(D)为未结合磷酸根时，镁离子与海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2相互作用图解。图3为结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2母体蛋白的酶活和突变体的酶活结果。其中左图为结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2母体蛋白的Km结果，右图为在底物海藻糖-6-磷酸浓度为0.15mM, 37摄氏度反应3分钟时测定的A630的光吸收值。


本发明涉及结核分枝杆菌海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2的表达、纯化和结晶方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2硒代蛋白质的载体构建、表达和纯化方法，具体地说就是将OtsB2的29位和133位的亮氨酸突变为甲硫氨酸，在大肠杆菌B121(DE3)中使用特殊培养基大量表达硒代蛋白OtsB2；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体的结晶方法；以及海藻糖-6-磷酸磷酸酶OtsB2与磷酸根的复合体晶体三维结构及其在结核分枝杆菌药物筛选及药物设计方面的应用。