专利名称：一种优质鸡抗a亚群禽白血病病毒的抗性分型方法我国是肉鸡生产大国和消费大国，肉鸡产量居世界第二位。2010年，我国优质鸡年出栏率达到50亿只，约占中国肉鸡产量的50%，中国成为世界最大的优质鸡生产基地和消费市场，优质鸡产业已成为最具有中国特色的家禽产业，在国际市场上优势地位明显。本课题组多年流行病学调查结果显示，禽白血病在优质鸡中的发病率高于快大型肉鸡，成为威胁优质鸡产业的主要疾病之一。 禽白血病是由禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus, ALV)引起的以造血细胞恶性增生为主的一类免疫抑制性传染病。ALV分为A-J 10个亚群，A、B、C、D为外源性病毒，E 为内源性病毒(Bai, J. , Payne, L. N. & Skinner, M. A. 1995. HPRS-103 (exogenousavian leukosis virus, subgroup J) has an env gene related to those of endogenouselements EAV-O and E51 and an E element found previously only in sarcomaviruses J Virol., 69: 779-784; Benson, S. J. , Ruisj B. L，Garbers, A. L.，FadlyjA. M. & Conklin, K. F. 1998.Independent isolates of the emerging subgroup Javian leukosis virus derive from a common ancestor J Virol. , 72: 10301—10304;Payne, L N.，Gillespie, A. M. & Howes, K. 1992. Myeloid leukaemogenicity andtransmission of the HPRS-103 strain of avian leukosis virus Leukemia, 6:1167-1176)。在鸡群中A亚群病毒最常见，B亚群病毒次之。宿主范围广泛、感染率高、传播速度快和致死率高等特点。目前禽白血病的防控主要方法是通过淘汰阳性鸡来净化种群，没有疫苗进行免疫防控。ALV的清除是一项极其费力、费时且花费巨大的工作，鸡群中ALV的净化可能需要多年坚持不懈的努力。培育ALV抗性鸡是未来替代传统净化鸡群方法的必然趋势。制约ALV抗性育种的根本原因是没有切实可行的ALV抗性育种方法。遗传抗性和免疫接种是降低疾病危害的基本策略，而遗传抗性显然更符合可持续发展的要求，并且在一定程度上具有一劳“永”逸的意义。显然，从遗传角度选育对禽白血病具有抗性的鸡是完全可行。在鸡ALV的遗传抗性研究上，Zhang的团队研究了 ALV-BDE抗性鸡与易感鸡的禽白血病受体基因情况，建立了快速监测ALV-BDE抗性鸡和易感鸡的方法(Zhang, H. M. , Bacon, L. D. , Cheng, Η. H.& Hunt, H. D. 2005.Development and validation of a PCR-RFLP assay to evaluateTVB haplotypes coding receptors for subgroup B and subgroup E avian leukosisviruses in White Leghorns Avian Pathol. , 34: 324-331),为 ALV_BDE 的抗性育种和本项目的深入研究打下基础(Zhang et al, 2005)。Zekarias等(Zekarias, B.,Songserm, T. , Post, J. , Kok, G. L. , Pol, J. Μ. , Engel, B. & ter, H. A. 2002.Development of organs and intestinal mucosa leukocytes in four broiler linesthat differ in susceptibility to malabsorption syndrome Poult.Sci., 81:1283-1288)认为鸡的遗传抗性主要由免疫系统及一些生理和环境因子来控制。在获得性免疫反应中，抗原的特异性识别、抗原递呈细胞(APC)-抗原肽-主要组织相容性复合体(MHC)之间关系、T细胞和B细胞的激活都可以影响免疫应答。MHC、T细胞亚群、免疫球蛋白和细胞因子等的网络调节作用很大程度上决定了鸡的天然抗病力的强弱。因此，负责编码这些蛋白成分的基因的内在多态性直接影响着机体的抗病能力。目前所发现的与鸡综合抗病力有关的基因不多，研究主要围绕主要组织相容性复合体(MHC)、天然抗性相关巨噬蛋白I (NRAMPl)、模式识别受体编码基因、干扰素基因(IFN)和鸡的免疫球蛋白编码基因等(刘红等，2006)。鸡中存在着一些可调节机体对某些特定病原(禽白血病病毒、马立克氏病病毒、沙门氏菌、传染性法氏囊病病毒、球虫等)不易感的基因；白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子及生长因子等均可被当成机体抗病性的候选基因而加以利用，这方面的报道目前主要以揭示人类疾病发生的遗传控制机理为主(刘红，廖明，曹伟胜.2006.抗性基因在鸡抗病育种中的研究进展.中国家禽，28(17):55-57;Kramer, J. , Malekj M. & Lamontj S. J. 2003. Association of twelve candidate genepolymorphisms and response to challenge with Salmonella enteritidis in poultry Anim Genet. , 34: 339-348)。对于这些因子与疾病的联系，虽然对畜禽尚无多少成果报道，但可以借鉴人类的研究成果来揭示畜禽疾病的遗传控制机理。如何通过遗传标记辅助选择将抗性基因运用于抗病育种，并发现新的与抗病性状连锁的遗传标记将是优质鸡抗病育种的热点。鸡抗病性的遗传基础研究，建立鸡的抗性基因分型育种方法，快速选育抗性个体更是优质鸡产业发展极其紧迫的工作。2000年，欧洲5个学术团体和2个公司合作开始了一个大规模的合作，目的是了解鸡抗病性的遗传基础，并且能建立快速简单地发现抗性个体的遗传实验，这项计划被称为IMAGE，是第一个对家禽免疫表达基因进行测序，也是唯一的聚焦于研究疾病领域的遗传基因功能研究。他们主要集中于三种疾病的抗病性研究(传染性法氏囊病、马立克氏病和球虫病)，研究结果发现在正常鸡和具有抗病性的鸡之间某些基因的表达有明显差别。项目负责人指出，接下来的研究主要集中于研究由免疫产生的抗病力和天然抗病力的区别。一般抗病力受多基因或环境影响。鸡一般抗病遗传力估计在0. I 以下(Bacon, L. D. , Hunt, H. D. & Cheng, H. H. 2000. A review of the developmentof chicken lines to resolve genes determining resistance to diseases PoultSci, 79:1082-1093)，而特殊抗病遗传力常常较高(Govora，J. S., Spencer, J. L，Okadaj I. & Grunderj A. A. 1990.Correlation of genetic resistance of chickensto Marekis disease viruses with vaccination protection and in vivo response tophytohemaglutinin Genet. Sel. Evol. , 22: 457)。不同遗传背景的鸡对ALV-A亚群的易感性不同，选育LVA-A亚群抗性鸡是防控禽白血病的主要手段之一。Elleder D 等(Elleder，D.，Melderj D. C.，Trejbalovaj K·，Svobodaj J. & Federspielj M. J. 2004a. Two different molecular defects in the Tvareceptor gene explain the resistance of two tvar lines of chickens to infectionby subgroup A avian sarcoma and leukosis viruses J. Virol., 78: 13489-13500)研究得出禽白血病病毒(ALV)是通过特定膜蛋白作为受体位点吸附进入细胞的，其中ALV-A亚型受体为tva，相应的编码基因属于低密度脂蛋白受体家族成员；ALV-B、ALV-D,ALV-E亚型受体是tvb，相对应的编码基因是肿瘤坏死家族的成员；ALV-C亚型的受体是tvc0 Elleder D 等(Elleder, D. , Plachy, J. , Hejnar, J. , Geryk, J. & Svoboda, J.2004b.Close linkage of genes encoding receptors for subgroups A and C of aviansarcoma/leucosis virus on chicken chromosome 28 Anim Genet. , 35: 176-181)石开究发现易感鸡的DT40细胞能通过同源重组破坏tvc等位基因而抗ALV-C的感染。ZekariasB 等(Zekarias, B. , Songserm, T. , Post, J. , Kok, G. L. , Pol, J. Μ. , Engel, B. &ter, H.A. 2002. Development of organs and intestinal mucosa leukocytes in fourbroiler lines that differ in susceptibility to malabsorption syndrome Poult.Sci., 81: 1283-1288)表明，一些内源性反转录病毒基因表达的膜糖蛋白(如gp85)可阻断ALV受体，使机体产生抗ALV抗性，而且这种抗性可垂直传播。ALV的抗性基因的挖掘和抗性育种方法的建立具有极为重要的意义和价值。目前ALV还没有好的疫苗可用于该病的防控，而且没有关于优质鸡抗禽白血病A的抗性基因的任何报道，没有一个成熟的抗性基因可应用于优质鸡抗ALV-A的遗传抗病性 选育，更没有相关的优质鸡抗禽白血病A抗性分型育种方法的建立，这对优质鸡ALV抗病育种提出了巨大的挑战。
本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的 本发明根据ALV-A的受体基因TVA为研究对象，发现该TVA基因的第619位核苷酸具有多态性，因而设计PCR-RFLP实验，同时结合TVA基因序列305 308位是否有4_base(CGCT)，来对鸡进行A亚群禽白血病病毒抗性基因分型。一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法(以下简称抗性分型方法)，以TVA基因序列619位的SNP位点为研究对象，进行PCR-RLFP分析，检测SNP位点是否发生突变，同时结合TVA基因序列的测序检测305 308位点是否有4个碱基的插入； 按如下标准进行基因抗性分析 遗传易感型=TVA基因序列两个等位基因619位的SNP位点均未发生突变且305 308位点无4个碱基的插入、TVA基因序列其中一个等位基因619位的SNP位点发生突变且305^308位点均无4个碱基的插入，或TVA基因序列其中一个等位基因619位的SNP位点未发生突变且另一个等位基因305 308位点有4个碱基的插入； 遗传抗性型TVA基因序列619位的SNP位点均发生突变且305 308位点无4个碱基的插入、TVA基因序列其中一个等位基因619位的SNP位点发生突变且另一个等位基因305^308位点有4个碱基的插入，或TVA基因序列两个等位基因305 308位点均有4个碱基的插入。作为一种优选方案，上述抗性分型方法中所述SNP位点发生突变是由C突变为G，4个碱基为CGCT。
作为一种优选方案，上述抗性分型方法中所述PCR-RLFP分析中，以鸡全基因组DNA为模板，引物核苷酸序列如SEQ ID NO: Γ2所示，PCR方法扩增包含TVA基因619位点的片段(以下简称TVA619片段)，扩增产物用Ar I酶进行酶切。作为一种优选方案，上述抗性分型方法中，在进行PCR-RLFP分析后还有一个焦磷酸测序步骤,验证SNP位点是否发生突变，测序引物核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所示。作为一种优选方案，上述抗性分型方法中，TVA基因序列的测序首先以SEQ IDNO: 4^5所示核苷酸序列为引物，PCR方法扩增包含TVA基因305 308位点的片段(以下简称TVA223片段)，扩增产物用焦磷酸测序方法进行测序。焦磷酸测序的引物核苷酸序列优选如SEQ ID NO:6 所示。本发明的实验原理如下
I.根据已知TVA基因的mRNA序列(GenBank登录号AY531262. 1，该基因DNA核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示)上的619位核苷酸多态性设计PCR-RFLP实验。具体方法为根 据TVA基因mRNA序列上的619位的SNP位点(C/G)，设计PCR-RFLP的扩增引物序列例如TVA6195、TVA6193，引物TVA6193用生物素标记。在TVA6195序列的5，端带有fer I酶切位点CTCTT，引物序列见表I。抽提鸡的基因组DNA，用引物TVA6195和TVA6193扩增的片段长69bp。然后用fer I酶切，上述PCR的产物用fer I内切酶酶切可以看到不同大小的酶切条带，分别为69bp、38bp、31bp。如果该PCR产物能被fer I酶完全或不完全切开，则该SNP位点的核苷酸为C或含有C，如为遗传易感型(完全切开定义为TVA*S，不完全切开定义为TVA*S/R1);如不能切开，则该位点的核苷酸为G，为遗传抗性型(定义为TVA*R1)。2.同时用619位SNP位点的焦磷酸测序(Pyrosequence)方法进行SNP测序验证，测序引物Pyro_primer619(见表I)。TVA619 SNP位点的pyrosequence测序的引物和位置见图I。如果619位点的核苷酸为C，为遗传易感型(上述的TVA*S)，若果619位点的核苷酸可能是C或G，则为杂合易感型(上述的TVA*S/R1);如该位点的核苷酸为G，为遗传抗性型(上述的TVA*R1)。3.本发明根据TVA基因的mRNA序列(GenBank登录号AY531262. I)的305 308位4-base插入的情况设计焦磷酸测序(pyrosequence)实验。TVA的305 308位有4-base的插入，则该鸡为ALV-A的遗传抗性型；反之为遗传易感型。根据TVA基因的mRNA序列设计引物，例如TVA2235、TVA2233和Pyro_primer223，引物TVA2233用生物素标记。引物序列见表I。TVA619 SNP位点的pyrosequence测序的引物和位置见图2。抽提鸡的基因组DNAj引物TVA2235和TVA2233扩增样品的PCR产物为223bp，然后用焦磷酸测序(pyrosequence)测序仪进行4-base插入位点的测序。若有4_base插入，则为遗传抗性型(定义为TVA*R2);如没有4-base插入，则为遗传易感型(同样属于TVA*S)。4.本发明根据PCR-RFLP和4-base pyrosequence测序的结果,制定判定鸡抗A亚群禽白血病病毒(ALV-A)的基因型的标准。TVA是ALV-A亚型禽白血病病毒进入宿主的受体基因。本发明定义的TVA抗性有三个等位基因，即TVA*S，TVA*R1和TVA*R2。所以就有六种基因型，TVA*S/S、TVA*S/R1、TVA*S/R2、TVA*R1/R1、TVA*R1/R2、TVA*R2/R2。一只鸡如果带有一个或两个TVA*S等位基因，这只鸡将是ALV-A的易感型，即遗传易感型。一只鸡如果带有一个TVA*R1和一个TVA*R2、或者两个TVA*R1或两个TVA*R2等位基因，那么，这只鸡就是抗ALV-A的基因型，即遗传抗性型。基因型分型判定如表2。
5、结合2、3的方法，按照4的标准，建立鸡抗A亚群禽白血病病毒(ALV-A)的抗性基因分型方法。表I PCR扩增和焦磷酸测序引物


本发明公开了一种优质鸡抗A亚群禽白血病病毒的抗性分型方法，是以TVA基因序列619位的SNP位点为研究对象，进行PCR-RLFP分析，检测SNP位点是否发生突变，同时结合检测TVA基因序列305~308位的SNP位点是否有4个碱基的插入，两者检测结果相结合共同判定被检测鸡为遗传抗性型还是遗传易感型。本发明的抗性分型方法从源头上进行检测，省去了后期检测的麻烦，同时该检测方法快速准确，目的性强，操作简单，具有实践意义，可以对鸡进行遗传性状的快速选择以提高品系的抗病性。