专利名称：淀粉样变性疾病的预防和治疗的制作方法淀粉样变性是描述一些可以局部或全身地出现的蛋白质原纤维细胞外沉淀，形成许多的“淀粉样沉淀”的疾病通用术语。这些沉淀的原纤维组分为各种形式的淀粉样疾病的识别特征。例如，以主要由β淀粉样蛋白肽(β-AP)原纤维组成的脑内和脑血管的沉淀为特征的阿尔茨海默氏病(家族性和偶尔发生的)，以胰岛淀粉样蛋白质肽(IAPP；糊精)为特征的与II型糖尿病有关的胰岛细胞淀粉样蛋白沉淀中的原纤维，和由于长期的血液透析治疗形成的以β2-微球蛋白为主要组分的淀粉样蛋白沉淀。新近，与蛋白感染素有关的疾病，例如克雅氏病(Creutzfeld-Jacob)，也被认为是淀粉样蛋白疾病。主要根据淀粉样变性病是否与原发性系统疾病有关，将各种形式的疾病分类。因此，某些疾病被认为是原发性淀粉样变性，先前存在或共存的疾病中并无证据。通常，原发性淀粉样变性疾病的特征为存在“轻链型淀粉样蛋白”(AL型)蛋白质原纤维，因此将AL原纤维N-末端区的同源性称为免疫球蛋白轻链的可变的片段(κ或λ)。二级或“反应性”淀粉样变性的特征为源自血清淀粉样蛋白质A(ApoSSA)的AA型原纤维沉淀。这些淀粉样变性形式的特征为原发性慢性炎症或传染病状(例如，风湿性关节炎，骨髓炎，肺结核，麻疯病)。家族遗传性的淀粉样变性可能与ATTR运甲状腺素蛋白型的神经性的、肾的或心血管的沉淀有关。其他的家族遗传性的淀粉样变性包括其他的综合症，并可能具有不同的淀粉样组分(例如，以AA原纤维为特征的家族性的地中海热)。其他形式的淀粉样变性包括出现于离体器官的、以病灶的，通常为肿块样沉淀为特征的局部形式。Othere淀粉样变性与年龄有关，通常以在心或脑形成蚀斑为特征。淀粉样沉淀通常也与长期的血液透析有关。这些及其他形式的淀粉样蛋白病概括于表1(Tan，S.Y.和Pepys，(Histopathology，25403-414，1994；Harrison的Harrison’s Handbook of Internal Medicine，第十三版，Isselbacher，K.J.等，编著，McGraw-Hill，San Francisco，1995)。a精囊腺外分泌蛋白质通常，形成大部分淀粉样沉淀的原纤维源自于一种或多种初级前体蛋白质或肽，通常与硫酸盐化氨基葡聚糖有关。另外，如下文详述，淀粉样沉淀可以包括各种型式的较小的蛋白质和肽，以及其他组分，例如含蛋白多糖，神经节苷脂和其他糖。目前，对于任何淀粉样疾病没有特效的、直接针对淀粉样疾病的治疗。对于原发疾病或相关的疾病状态，治疗是通过治疗原发疾病从而减少淀粉样变性蛋白质的产生。例如，用抗生素治疗肺结核，从而减少微生物负荷，导致炎症的减少和相关的SSA蛋白质的减少。对于由多发性骨髓瘤引起的AL淀粉样变性，化疗有助于病人减少浆细胞，降低骨髓瘤免疫球蛋白水平。随该水平下降，可以清除AL淀粉样变性。共同拥有的1998年11月30日提出的美国专利申请USSN 09/201,430和1999年5月28日提出的USSN 09/322,289显示通过给用产生或给予直接针对β淀粉样变性肽(Aβ)及其片段的药剂，可以大大地减少(和预防)与阿尔茨海默氏病有关的淀粉样血小板负荷。本发明发现诱导针对各种淀粉样血小板组分的免疫反应可有效地治疗广谱淀粉样疾病。发明概述本发明涉及用于治疗多种淀粉样疾病的药物组合物和方法。本发明一个方面包括一种药物组合物，其中包括活性成分，即有效地诱导病人的针对淀粉样的成分的免疫反应的药剂。这样的组合物通常也包括赋形剂，在最优方案中可以包括辅剂。在进一步优选的方案中，辅剂包括，例如，氢氧化铝，磷酸铝，MPLTM，QS-21(StimulonTM)或弗氏不完全佐剂。按照有关的实施方案，药物组合物可以包括有效诱导病人针对超过一种的淀粉样成分的免疫反应的药剂。在有关的实施方案中，药剂有效地产生直接针对原纤维肽或蛋白质淀粉样成分的免疫反应。优选这样的原纤维肽或蛋白质源自于如本文所描述的，已知与某些形式的淀粉样疾病有关的原纤维前体蛋白。这样的前体蛋白质包括，但不局限于血清淀粉样A蛋白质(ApoSSA)、免疫球蛋白轻链、免疫球蛋白重链、ApoAI、运甲状腺素蛋白、溶菌酶、纤维根(fibrogen)α链、凝溶胶蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C、淀粉样β蛋白质前体(β-APP)、β2微球蛋白、蛋白感染素前体蛋白(PrP)、心钠素、角蛋白、胰岛淀粉样多肽、肽类激素和合成核素(synuclein)。这样的前体也包括突变株蛋白质、蛋白质片段和这样的前体的溶解蛋白肽。在一个优选方案中，药剂有效地诱导直接针对由有关原纤维前体蛋白的原纤维蛋白质或肽形成的新的表位的免疫反应。即，如本申请更详细的描述，许多形成原纤维的肽或蛋白质是如上述的这样的前体蛋白质的片段。当例如通过溶解蛋白分裂形成这样的片段时，表位可能显示不存在该前体，因此当片段是前体蛋白的一部分时，表位对免疫系统不具有免疫可用性。针对这样的表位的药剂可能是优选的治疗剂，因为它们诱导病人的自身免疫反应的可能性更小。
按照有关实施方案，本发明药物组合物包括针对淀粉样组分的药剂，这些组分例如选自，但不限于下列原纤维肽或蛋白质AA、AL、ATTR、AapoAl、Alys、Agel、Acys、Aβ、AB2M、Ascr、Acal、AIAPP和合成核素-NAC片段。这些肽的全称和组成描述于此。如本申请所述，这样的肽可按照本领域众所周知的方法制备。
按照另一个有关的实施方案，在这样的药物组合物中包含的药剂也包括某些硫酸盐化含蛋白多糖。在一个有关的实施方案中，该含蛋白多糖是硫酸肝素氨基多糖，优选基底膜聚糖、硫酸皮肤素、软骨素-4-硫酸酯或戊聚糖多硫酸酯。
按照另一个有关方面，本发明包括预防或治疗哺乳动物患者的淀粉样的沉淀病症的方法。按照本发明的该方面，对患者给用有效量的药剂，使其产生针对患者患有的以淀粉样的病症为特征的淀粉样组分的免疫反应。本质上来讲，该方法包括给用包含如上所述的对上述病症特效的致免疫的淀粉样组分的药物组合物。这样的方法的另外的特征是有效地诱导患者的致免疫反应。按照一个优选方案，该方法产生有效的免疫学反应，该反应的特征是相对于致免疫药剂直接针对的淀粉样组分的血清滴定度至少为1∶1000。在另一优选方案中，对于原纤维成分的最小血清滴定度为1∶5000。按照一个有关实施方案，免疫反应的特征为免疫活性血清的量比在预处理对照血清样品中测量的免疫活性的血清水平高四倍。后面的特征特别适于通过ELISA技术测量血清免疫活性，但是它也可适用于任何相对的或绝对的血清免疫活性的测量。按照优选方案，在血清稀释约1∶100时测量免疫活性。
按照另一个有关方面，本发明包括确定正在进行淀粉样病症治疗的患者预后的方法。此时，测量针对以选定的病症为特征的淀粉样组分的病人免疫活性的血清量，并且病人血清的免疫活性至少为血清免疫活性的基线对照水平的4倍，说明与特定淀粉样病症相关的预后状态得到改善。按照优选方案，针对存在于患者血清中的选定的淀粉样的成分的免疫活性的量的特征为关于淀粉样的成分具有至少约1∶1000，或至少1∶5000的血清滴定度。
按照另外的有关方面，本发明也包括用于预防或治疗淀粉样的疾病的所谓的“被动免疫”方法和药物组合物。按照本发明的这个方面，对病人给用有效剂量的与选择的淀粉样的成分特异结合的抗体，优选存在于作为被治疗疾病特征的淀粉样沉淀中的原纤维成分。通常，选择这样的抗体是因为它们具有特异结合本申请前述的药物组合物和方法中描述的各种的蛋白质、肽和组分的能力。按照有关实施方案，这样的方法和组合物可以包括结合至少两个淀粉样的原纤维组分的抗体的组合。通常，给用药物组合物可使针对目标淀粉样成分的血清免疫活性量比针对对照血清样品中测量的血清免疫活性水平高至少约四倍。如本申请所述，给用抗体时可能同时使用载体。通常，按照本发明的这个方面，这样的抗体可通过腹膜、口服、鼻腔内、皮下、肌内、局部或静脉内给药(或为给药将抗体制成制剂)，但是可以通过任何药学上有效的途径(即，如上述及此处所述，可有效地产生明显的治疗水平)给药或制成制剂。
按照有关实施方案，治疗抗体可能通过给用一种编码至少一个抗体链的多核苷酸进行给药。按照本发明的这个方面，在患者体内该表达多核苷酸以在患者体内产生药学上有效量的抗体链。这样的多核苷酸可以编码抗体的重链和轻链，从而在患者体内产生重链和轻链。
按照优选方案，上面描述的免疫疗法可以包括按照本领域已知方法，或按照患者需要，根据免疫学的反应评定以多剂量给用包括抗体在内的药剂，例如6月以上的周期，例如首次免疫一定间隔后例如6星期间隔加强注射。选择性地，或另外这样的疗法可以包括使用“持续释放”制剂，如本领域已知的那些。
当结合附图阅读下列本发明的详细说明时，更容易理解本发明的这些及其他目的和特征。
附图的简要描述

图1用Aβ-42注射后转基因小鼠的抗体滴定度。
图2海马体中的淀粉样蛋白的负荷。通过脑切片免疫活性的计算机辅助定量图像分析测定淀粉样的斑点占据海马体面积的百分比，由与Aβ-特异的单克隆抗体3D6的反应性定义。个体小鼠的数值显示为按处理组排序。各组水平线表示分布的中值。
图3海马体中的神经炎性营养不良。通过免疫活性脑切片的计算机辅助定量图像分析测定营养不良的轴突占据海马体面积的百分比，由与人体APP特异的单克隆8ES的反应性定义。个体小鼠的数值显示为AN1792处理组和PBS处理控制组。各组水平线表示分布的中值。
图4脾后皮层中的星形细胞增生。通过免疫活性脑切片定量计算机辅助图像分析测定神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性星形细胞占据皮层面积的百分比。通过处理组排序方式显示个体小鼠的值，水平线表示中间组值。
图5用包括0.14，0.4，1.2，3.7，11，33，100或300μg的八种剂量的Aβ42(“AN1792”)免疫后的Aβ42几何平均抗体滴定度。
图6AN1792免疫的抗体反应动力学。滴定度用每组6只动物的几何平均值来表示。
图7用PBS和用AN1792处理过的小鼠的皮层淀粉样蛋白负荷的定量图像分析。
图8用PBS和用AN1792处理过的小鼠的神经炎斑点负荷的定量图像分析。
图9用PBS和用AN1792处理过的小鼠星形细胞增生占据脾后皮层百分比的定量图像分析。
图10用AN1792处理过(上组)或用PBS处理过(下组)的小鼠的脾细胞淋巴细胞增生试验。
图11大脑皮质总的Aβ水平。使用同弗氏佐剂相结合的Aβ或APP衍生物对小鼠进行免疫作用的个体Aβ轮廓分布图。
图12通过使用Aβ肽共轭物Aβ1-5、Aβ1-12和Aβ13-28使小鼠免疫的免疫活性脑切片的定量图像分析测定的皮层淀粉样的负荷；全长Aβ集合Aβ42(“AN1792”)和Aβ1-40(“AN1528”)和PBS处理对照组。
图13用同弗氏佐剂相结合的Aβ或APP衍生物免疫的小鼠组的Aβ特异抗体的几何平均数滴定度。
图14用同各种辅剂相结合的AN1792或其棕榈酰基化衍生物免疫作用的豚鼠组的Aβ特异性抗体的几何平均数滴定度。
图15(A-E)用含不同辅剂的AN或AN1528处理的12个月大的PDAPP小鼠的皮层Aβ水平。
图16用Aβ的多克隆抗体处理的小鼠的平均滴定度。
图17用Aβ的单克隆抗体10d5处理的小鼠的平均滴定度。
图18用Aβ的单克隆抗体2F12处理的小鼠的平均滴定度。
发明的详细说明A.定义除非另有说明，本申请使用的全部术语具有与本发明领域技术人员已知的相同的含义。专业人员可具体参照Sambrook等的MolecularCloning(1989)A Laboratory Manual(第二版)，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.，和Ausubel，F.M.等的Current Protocols inMolecular Biology(1998)，John Wiley&Sons，New York，NY中生物化学和分子生物学领域已知的定义、术语和标准方法。当然本发明不局限于特别描述的方法、规定和试剂，因为它们可以变化而产生相同的结果。
术语“辅剂”指当与抗原一起给药时，会增加抗原的免疫反应，但是当其单独施用时不产生抗原免疫反应的化合物。辅剂可以通过若干机制包括补充淋巴细胞，刺激B和/或T细胞，以及刺激巨噬细胞增加免疫反应。
“淀粉样蛋白病”或“淀粉样变性”指症状或部分症状为淀粉样的斑点病理学累积或形成的所有病症。
“淀粉样的斑点”是主要由蛋白质的原纤维组成的细胞外的沉淀。通常，原纤维由占优势的蛋白质或肽组成；但是如本申请描述，斑点可能也包括另外的肽或非肽分子组分。
“淀粉样组分”是存在于淀粉样的斑点中的任何分子实体，包括此种分子的抗原部分。淀粉样组分包括但是不局限于蛋白质、肽、蛋白聚糖和碳水化合物。“特定的淀粉样的组分”指主要地或仅在所述的淀粉样的斑点中发现的分子实体。
“药剂”是合成的或生物学来源的化学分子。在本发明中，药剂通常为可被用于药物组合物的分子。
“抗淀粉样变性的药剂”是通过主动或被动免疫技术给药时，能够针对脊椎动物患者淀粉样的斑点组分产生免疫反应的药剂。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本申请可互换使用，指具有可支撑基底的主链的聚合分子，该基底可通过氢键键合到典型的多核苷酸上，该聚合物主链具有这样的基底，它在某种意义上允许可以一系列特殊方式在聚合的分子和典型的多核苷酸(例如，单链DNA)之间建立氢键。代表性的这样的基底为次黄嘌呤核苷、腺苷、鸟嘌呤核苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷。聚合的分子包括双链和单链RNA和DNA及其主链修饰，例如，膦酸甲酯连接。
本申请使用的术语“多肽”指由通过肽键连接的单链氨基酸残基组成的化合物。术语“蛋白质”可以与术语“多肽”同义或可以指两个或更多多肽的复合体。
术语“肽”也指由通过肽键连接的氨基酸残基组成的化合物。通常肽由100或更少氨基酸组成，而多肽或蛋白质具有100个以上的氨基酸。本申请使用的术语“蛋白质片段”也可以指肽。
“原纤维肽”或“原纤维蛋白质”指单体的或集合形式的蛋白质或肽，它们形成存在于淀粉样的斑点中的原纤维。本申请提供这样的肽和蛋白质的例子。
“药物组合物”指适于对哺乳动物个体给药的化学的或生物学的组合物。这样的组合物可以为通过一个或多个途径给药而制成特殊的制剂，该途径包括但并非限于口服、肠胃外、静脉内、动脉内、皮下、鼻腔内、舌下、脊柱内，大脑室内等等。
“药物赋形剂”或“药学上可接受的赋形剂”是一种载体，通常是液体，在其中配制活性治疗剂。在制剂中赋形剂通常不提供任何药理学的活性，可是它可以提供化学和/或生物学的稳定性、释放特性等等。制剂的例子可以从，例如，《雷氏药物科学》(Remington′sPharmaceutical Sciences)，第19版，Grennaro，A著，1995中找到。
“糖蛋白”是在其上可共价地连接至少一个碳水化合物链(寡糖/多糖)的蛋白质。
“含蛋白多糖”是其中至少一个碳水化合物链是氨基多糖的糖蛋白，该氨基多糖为重复二糖的长线型聚合物，其中一个通常是糖酸(糖醛酸)，另一个是氨基糖。
术语“免疫学的”或“免疫的”或“致免疫的”反应指脊椎动物个体中针对抗原的体液的(抗体介导的)和/或细胞的(通过抗原特异的T细胞或它们的分泌产品介导的)反应。这样的反应可以是通过给用免疫原诱导的主动反应，或通过给用抗体或预处理的T细胞诱导的被动反应。通过与Class I或Class II MEC分子相联系的多肽表位的表达激活抗原特异的CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞诱导细胞的免疫反应。该反应也可包括活化单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱细胞、树状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞或其他先天免疫的组分。通过本领域已知的标准增殖试验(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T细胞)试验可以测定细胞介导的免疫反应的存在。体液反应和细胞反应对免疫原的保护或治疗的效果的相对贡献可以通过分别地离析同种同基因的动物的免疫球蛋白(IgG)和T细胞片断，并测量第二名患者的保护或治疗效果来辨别。
“免疫药剂”或“免疫原”或“抗原”是对患者给药后能诱导针对它本身的免疫学反应的分子，既可与辅剂同时使用，也可无辅剂时使用。这样的分子包括，例如，与载体蛋白如钥孔血蓝素、Cd3或破伤风毒素共轭的淀粉样的原纤维肽或片段。
“表位”或“抗原决定区”指与抗体的抗原结合区域结合的抗原部分。
术语“Aβ”，“Aβ肽”和“淀粉样的β”肽是同义的，指一种或多种源自如本申请描述的β淀粉样的前体蛋白(βAPP)约38-43氨基酸的肽组合物。“Aβxx”指淀粉样的β肽1-xx，其中xx是显示肽中氨基酸数目的数字；例如Aβ42与Aβ1-42相同，在本申请中也相当于“AN1792”，Aβ40与Aβ1-40相同，在本申请中也相当于“AN1578”。
解聚的或单体的Aβ指可溶解的、Aβ的单体肽单位。一种制备单体Aβ的方法是使用超声处理将冻干的肽溶解在纯的DMSO中。将所得溶液离心除去不溶性颗粒。聚集的Aβ是其中单体的单位通过非共价键结合在一起的低聚物。
术语“裸多核苷酸”指没有与胶态物质复合的多核苷酸。裸多核苷酸有时在质粒载体中克隆。
术语“患者”包括接受预防或治疗的人及其他哺乳动物患者。
术语“显著不同的”，“统计上显著的”，“显著地高(或低)”和类似的字句指数据或其它测量值之间的比较，其中两个比较的个体或组的差异对于有训练的观测者显著地或相当不同，或统计上显著(如果本短语包括术语“统计上地”或如果有一些统计试验的指标，例如p-值或通过本领域已知的标准统计检验分析时，数据产生统计的差异)。
“包括”一种或多种叙述要素的组合物或方法可以包括其他的不特定叙述的要素。例如，包括原纤维成分肽的组合物也包括离析肽和作为较大的多肽序列的组分的肽。还例如包括要素A和B的组合物也包括由A，B和C组成的组合物。B.淀粉样的疾病1.综述和发病机理淀粉样的疾病或淀粉样变性包括一些具有各式各样的外在症状的疾病状态。这些病症都具有蛋白质原纤维的反常细胞外沉淀，称为“淀粉样沉淀”或“淀粉样斑点”，它们的直径通常约10-100μm，位于特定的器官或组织区域。这样的斑点主要由天然的可溶解的蛋白质或肽组成。这些不溶的沉淀通常由直径为大约10-15nm的原纤维侧向聚集体组成。当用刚果红染料着色时，淀粉样原纤维在偏振光下产生特有的苹果绿双折射。如下所述，根据形成斑点沉淀的主要原纤维组分将病症分类。
形成斑点沉淀的肽或蛋白质经常由较大的前体蛋白产生。更具体地说，淀粉样的原纤维沉淀的发病机理通常包括“反常的”前体蛋白溶解蛋白分裂成片段。这些片段通常聚集变成逆平行β折叠片；可是，在家族性淀粉样多发性神经病(变体运甲状腺素蛋白原纤维)和与渗析有关的淀粉样变性(β2微球蛋白原纤维)中，某些前体蛋白的未离解形式聚集并形成原纤维(Tan等，1994，同上)。2.临床综合症本部分描述主要的淀粉样变性类型，包括它们特有的斑点原纤维成分。本发明发现，可以通过给与用来刺激针对各种病原特异的淀粉样的沉淀的一种或多种组分的免疫反应的药剂治疗淀粉样的疾病。如下面C章节更详细的论述，这样的组分优选是形成斑点的原纤维的组分。以下章节用来例举主要的淀粉样变性的形式，但并不打算限制本发明。a.AA(反应性)淀粉样变性通常，AA淀粉样变性是引起持续急性阶段反应的疾病的表现形式。这样的疾病包括慢性的炎症性的病症、慢性的局部或全身的微生物感染和恶性肿瘤。
AA原纤维通常由通过血清淀粉样的A蛋白质(apoSSA)，一种存在于HDL粒子并且响应如IL-1，IL-6和TNF的细胞活素而合成的循环脱脂蛋白，溶解蛋白切割形成的8000道尔顿片段(AA肽或蛋白质)组成。沉淀可在身体内广泛分布，尤其是实质器官。脾为常见的沉淀位置，并且也可能影响肾。沉淀也常见于心脏和胃肠道。
AA淀粉样疾病包括，但是不局限于炎症性的疾病，例如类风湿性的关节炎、少年慢性关节炎、僵硬性脊椎炎、牛皮癣、牛皮癣性关节病、瑞特氏综合症、成人斯蒂尔病、贝切特氏综合症和克罗恩氏病。AA沉淀也产生于慢性的微生物感染，例如麻疯病、肺结核、支气管扩张、褥疮、慢性肾盂肾炎、骨髓炎和惠普尔病。某些恶性肿瘤也会导致AA原纤维淀粉样沉淀。其中包括如霍奇金淋巴瘤、肾癌、肠癌、肺癌和泌尿生殖道癌、皮肤基底细胞癌和毛细胞白血病。b.AL淀粉样变性AL淀粉样的沉淀通常与几乎所有B淋巴细胞血统的体液不调有联系，从浆细胞恶性肿瘤(多发性骨髓瘤)到良性的单株丙种球蛋白病。有时，淀粉样沉淀的存在可能是原发性体液不调的主要指标。
AL淀粉样沉淀的原纤维由单克隆免疫球蛋白轻链或其片段组成。更具体地说，该片段源自于轻链(κ或λ)的N-末端区域并包含全部或一部分可变的(V1)范围。沉淀通常出现于间叶组织，导致周围和自发神经病、腕管综合症、舌肥大、限制性心肌病、大关节关节病、免疫的体液不调、骨髓瘤以及隐性体液不调。可是，应当注意到可能包括几乎所有组织，特别是脏器，例如心脏。C.遗传性的系统性淀粉样变性有许多形式的遗传性系统性淀粉样变性。虽然它们相对较少，但是由于症状从成人开始以及它们的遗传图谱(通常染色体占优势)，导致这样的病症在总人口中持久存在。通常，该综合症可归因于导致产生变体淀粉样变性肽或蛋白质的前体蛋白中的点突变。表2概括了这些病症的示例形式的原纤维组合物。
表2
表2提供的数据是示范性的，并不打算限制本发明的范围。例如，已经描述了超过40个运甲状腺素蛋白基因的独立的点突变，都引起了临床上相似形式的家族性淀粉样多发性神经病。
运甲状腺素蛋白(TTR)是14千道尔顿蛋白质，有时也称为前清蛋白。它是通过肝脏和脉络丛产生的，它的功能为运输甲状腺激素和维生素A。至少有50种蛋白质变体形式，各以单一氨基酸变化为特征，是各种形式的家族淀粉样多发性神经病的原因。例如，在丹麦病人中，将位置55的亮氨酸置换为脯氨酸导致特别的进行性神经病形式；将位置111的亮氨酸置换为甲硫氨酸导致严重的心脏病。从系统性淀粉样变性病人心脏组织分离的淀粉样的沉淀显示该沉淀由TTR和其片段的非均匀混合物组成，总起来称为ATTR，其全长序列已经被鉴定。ATTR原纤维组分可以从这样的斑点中提取，可按照本领域已知的方法例如，Gustavsson，A.等，Laboratory Invest.73703-708，1995；Kametani，F.等，“生物化学、生物物理研究通讯”(Biochem.Biophys.Res.Commun.)，125622-628，1984；Pras，M.等，PNAS 80539-42，1983)测定它们的结构和序列。
在分子脱脂蛋白AI中具有点突变(例如，Gly→Arg6；Trp→Arg50；Leu→Arg60)的人显示以蛋白质脱脂蛋白AI或其片段(AApoAI)沉淀为特征的淀粉样变性(“奥斯特塔格型”)。这些病人具有低水平的高密度脂蛋白(DHL)，并存在周围神经病或肾衰竭。
在溶菌酶的α链中的突变(例如，Ile→Thr56或Asp→His57)是在英国家庭中报道的奥斯特塔格型非神经性的遗传性淀粉样变性的另一个形式。这里，突变株溶菌酶蛋白质(Alys)的原纤维沉淀，病人通常显示削弱的肾功能。这种蛋白质不同于本申请描述的大多数形成原纤维的蛋白质，通常以整体形式(非片段)存在(Benson，M.D.等，CIBA FdnSymp.199104-131，1996)。
β-淀粉样的肽(Aβ)是通过解朊作用从称为β淀粉样的前体蛋白(βAPP)的大蛋白质衍生而来的39-43氨基酸肽。βAPP中的突变导致阿尔茨海默氏病、唐氏综合症和/或老年性痴呆的家族形式，其特征为由Aβ原纤维及其他组分组成的大脑斑点沉淀，这将在以下更详细地描述。与阿尔茨海默氏病有关的已知的APP中的突变发生于β或γ分泌酶切割位点的附近，或Aβ内部。例如，位置717距APPγ-分泌酶切割转化为Aβ的位置很近，而位置670/671距β分泌酶切割的位置最近。通过增加从APP产生的Aβ形式的42/43氨基酸的数量，在任何残基上的突变都可能导致阿尔茨海默氏病。各种长度的Aβ肽的结构和序列在本领域为大家所熟知。可按照本领域已知的方法(例如Glenner和Wong，Biochem Biophys.Res.Comm.129885-890，1984；Glenner和Wong，Biochem Biophys.Res.Comm.1221131-1135，1984)制备这样的肽。另外，各种形式的肽可以购得。
合成核素是与脂蛋白类似的与突触有关的蛋白质，有很多神经元细胞溶质和突触前的末端。源自α-合成核素的肽片段，称为NAC，也是阿尔茨海默氏病淀粉样斑点的组分。(Clayton，等，1998)。如下文详细描述，这些组分也是本发明免疫治疗的目标。
凝溶胶蛋白是钙结合蛋白，与肌动蛋白微丝结合并将其打断。在蛋白质位置187的突变(例如，Asp→Asn；Asp→Tyr)导致遗传性的系统性淀粉样变性的形成，通常发现于芬兰，以及荷兰或日本患者。在患病的个体中，由凝溶胶蛋白片段(Agel)形成的原纤维，通常由氨基酸173-243(68kDa羧基末端片段)组成，在血管和基底膜沉淀，导致角膜营养不良和头盖神经病，并发展为周围神经病、皮肤营养不良以及在其他器官的沉淀。(Kangas，H.等，人类分子遗传学(Human Mol.Genet.)5(9)1237-1243，1996)。
其他突变的蛋白质例如纤维蛋白原的突变株α链(AfibA)和抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C突变株(Acys)也形成原纤维，并产生特有的遗传性的病症。AfibA原纤维形成特征为并发肾病的非神经性遗传性淀粉样沉淀；Acys沉淀的特征为冰岛报道的遗传性大脑淀粉样血管病。(Isselbacher，等，Harrison′s Principles of Internal Medicine，McGraw-Hill，San Francisco，1995；Benson，等，同上)。在至少某些情况下，具有大脑淀粉样血管病(CAA)的病人已经显示具有包含与β蛋白质结合的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C非突变株的淀粉样的原纤维(Nagal，A.等，Molec.Chem.Neuropathol.3363-78，1998)。
蛋白感染素疾病的某些形式现在被认为是可遗传的，这解释了至多15％的情况，它们以前被认为主要是传染性的。(Baldwin等，《阿尔茨海默氏病及相关疾病的研究进展》(Research Advances inAlzheimer’s Disease and Related Disorders)，JoIm Wiley and Sons，NewYork，1995)。在这样的蛋白感染素病症中，病人生长了由正常蛋白感染素蛋白质(Prpc)的反常的异构体组成的斑点。一种主要的突变株异构体PrPSc，也称为AScr，与正常细胞的蛋白质的不同之处在于它对抗蛋白酶退化，在抽出溶剂后不溶解，在次级溶酶体中沉淀，平移后接合以及具有高β-折叠片含量。遗传连锁发展了至少五种突变，导致克雅氏症(CJD)，格-施-沙综合症(GSS)和致命家族性失眠(FFI)。Baldwin从痒病原纤维提取原纤维肽，测定序列以及制备这样的肽的方法在本领域是已知的。(例如Beekes，M.等，J.Gen.Virol.762567-76，1995)。
例如，一种GSS形式与遗传密码102位置的PrP突变有关系，而终脑(telencephalic)GSS与遗传密码117位置的突变隔离。在遗传密码198和217位的突变导致的GSS形式中，作为阿尔茨海默氏病特征的神经炎斑点包含PrP代替了Aβ肽。家族性CJD的某些形式与遗传密码200和210位的突变有联系；已经在家族性CJD和FFI找到遗传密码129和178位的突变(Baldwin，同上)。d.老年系统性淀粉样变系统的或局部的淀粉样沉淀随着年龄增加而增加。例如，野生型运甲状腺素蛋白(TTR)原纤维通常发现于年长个体的心脏组织中。它们可能无症状，临床上无反应，或可以导致心力衰竭。无症状的原纤维局部的沉淀也可能出现在脑部(Aβ)、前列腺的全部淀粉样蛋白(Aβ2微球蛋白)、关节和精囊腺中。e.大脑的淀粉样变性淀粉样的局部沉淀常见于脑，尤其是年长的个体。脑部最常见类型的淀粉样蛋白主要由Aβ肽原纤维组成，导致痴呆或突发性(非遗传性的)阿尔茨海默氏病。事实上，突发性阿尔茨海默氏病的发生率大大地超过遗传性的形式。关于阿尔茨海默氏病的遗传性类型(AD)，形成这些斑点的原纤维肽非常类似于上面的描述。f.与透析有关的淀粉样变性由β2微球蛋白(Aβ2M)原纤维组成的斑点通常发生在长期接受血液透析或腹膜透析的病人中。β2微球蛋白是11.8千道尔顿多肽，存在于所有的有核细胞中的Class I MHC抗原的轻链。在正常的环境下，它连续地从细胞膜脱落并通常被肾过滤。间隙破坏，例如肾功能损伤，导致在肾及其他位置(主要是关节的富含胶原的组织)沉淀。与其他的原纤维蛋白质不同，Aβ2M分子通常以非片段形式存在于原纤维中(Benson，同上)。g.激素衍生的淀粉样变性内分泌器官可以藏匿淀粉样的.沉淀，尤其是在老化的个体中。分泌激素的肿块可能同时包含激素衍生的淀粉样的斑点，其中原纤维由多肽激素例如降血钙素(甲状腺髓样癌)、胰岛淀粉样多肽(糊精；出现在大多数II型糖尿病患者中)和心钠素(分离的前房淀粉样变性)组成。这些蛋白质的序列和结构在本领域为大家所熟知。h.混杂的淀粉样变性有多种其他淀粉样蛋白病的形式，通常表现为淀粉样蛋白的局部化沉淀。通常来讲，这些疾病可能源自特定的原纤维前体的局部化产生和/或分解代谢的缺少或特定的组织(例如关节)形成原纤维沉淀的倾向性。这样的自发沉淀的例子包括小节的AL淀粉样变性、皮肤的淀粉样变性、内分泌的淀粉样变性和与肿瘤有关的淀粉样变性。C.药物组合物本发明发现能够诱导或提供针对淀粉样斑点的某些组分的免疫反应的组合物可有效地治疗或预防淀粉样的疾病的发展。特别是，按照本申请提供的发明，当给予患者免疫刺激剂量的抗淀粉样变性药剂，或相应的抗淀粉样的免疫试剂时，可预防症状的发展，改善症状和/或减少患者淀粉样的斑点负荷。本节描述产生主动的以及被动的对淀粉样的斑点的免疫反应的抗淀粉样变性药剂的例子，并提供显示在淀粉样的斑点负荷上使用这样的组合物的治疗效果的示例数据。
通常，如上述章节所述和下面的例证，本发明抗淀粉样蛋白的药剂由特定的斑点组分，优选原纤维形成组分，通常是特有的蛋白质，肽或其片段组成。更一般来说，本发明使用的治疗剂产生或诱导针对斑点，或更特别地，其原纤维组分的免疫反应。因此这样的药剂包括，但是不局限于诱导抗体和/或与抗体交叉反应的组分本身和其变体，类似物和模拟物，以及与淀粉样组分特异反应的抗体或T细胞。按照本发明一个重要的特征，药物组合物不选自非特异性的组分，即通常循环于体内或遍及体内的组分。例如，血清淀粉样蛋白(SAP)是在肝脏产生的循环血浆糖蛋白，它与大多数已知形式的淀粉样沉淀结合。治疗组合物优选涉及这些组分。
当给用免疫原诱导抗体或T细胞与患者组分反应时，免疫反应可以是主动的，当给用本身与患者组分结合起来的抗体时，免疫反应可以是被动的。诱导或产生针对淀粉样的斑点的免疫反应的药剂的例子在以下章节描述。
除致免疫的药剂之外，本发明药物组合物可以包括有效量的辅剂和/或赋形剂。药学上有效的有用的辅剂和赋形剂在本领域为大家所熟知，在下述的章节将更详细地描述。
I.免疫刺激药剂(主动免疫反应)a.抗原纤维组合物普通类优选的抗淀粉样变性药剂由源自淀粉样的原纤维蛋白质的药剂组成。如上所述，淀粉样的疾病的标志是主要由原纤维组成的在器官或淀粉样的斑点的器官中的沉淀，该原纤维又由特定的原纤维蛋白质或肽组成。按照本发明，这样的原纤维或肽组分是诱导抗淀粉样免疫反应的有用药剂。
表1和2概括了作为各种淀粉样的疾病特征的形成原纤维的蛋白质的例子。按照本发明的这个方面，对患者或易受影响的个体给用免疫刺激组合物，该组合物包括适当的原纤维蛋白质或肽，包括其类似物或片段，可治疗或预防淀粉样蛋白病。
例如，Aβ，亦称β-淀粉样的肽，或A4肽(见美国专利4,666,829；Glenner&Wong，Biochem.Biophys.Res.Commun.120，1131(1984))，是39-43个氨基酸的肽，是阿尔茨海默氏病特有的斑点的主要成分。Aβ是通过两个酶，β和γ分泌酶处理较大的蛋白质APP而产生的(见Hardy，TINS 20，154(1997))。
实施例I描述了支持本发明的实验结果，其中对过量表达在位置717具有突变的人类APP的杂合子转基因小鼠给用Aβ42肽。这些被称为“PDAPP小鼠”的小鼠显示阿尔茨海默氏病样的病状，被认为是阿尔茨海默氏病的动物模型(Games，等，《自然》(Nature)373523-7，1995。如在本例中的详细描述，这些小鼠从约6月龄开始可在脑内检测到神经病理学斑点，斑点沉淀随时间而发展。本申请描述的该实验中，将集合的Aβ2(AN1792)给予小鼠。在大多数被处理的13月龄小鼠(7/9)的脑中没有检测到淀粉样变性，与此相反，在此年龄段对照小鼠(盐水注射或未经处理的)都显示显著的脑淀粉样蛋白的负荷(图2)。这些差异在海马体更明显(图3)。处理过的小鼠也显示显著的针对Aβ的血清抗体滴定度(全部大于1∶1000，8/9大于1/10,000；图1，表3A)。通常，在1∶100稀释试验中，盐水-处理小鼠一直显示小于4-5倍针对Aβ的抗体的本底水平，因此认为相对于对照组没有明显应答(表3B)。这些研究证明注射形成肽Aβ的特定的原纤维可防止Aβ淀粉样的斑点沉淀。
血清淀粉样蛋白(SAP)是产生于肝脏的循环血浆糖蛋白，以依赖钙的方式与所有形式的淀粉样的原纤维结合，包括阿尔茨海默氏病中的大脑淀粉样斑点的原纤维。作为上述实验的一部分，对一组小鼠注射SAP；这些小鼠对SAP产生了显著的血清滴定度(1∶1000-1∶30000)，但是对Aβ肽没有产生可检测的血清滴定度，产生大脑斑点神经病理学机制(图2)。
在实施例II详细描述的另一些实验证明在5周到约8月龄之间的被处理小鼠中，注射Aβ的致免疫的效果依赖于剂量。在这些小鼠中，抗Aβ肽抗体的平均血清滴定度随免疫接种数目和剂量增加而增加；可是，四次免疫接种后，测量免疫接种后五天的滴定度高于高剂量(1-300μg)免疫接种，稳定在约1∶10000的水平(图5)。
实施例III描述支持本发明的另外的试验，其中在淀粉样的斑点已经存在于PDAPP模型小鼠(约11月龄)的脑中之后，在一个时间点用Aβ42处理它们。在这些研究中，用Aβ42或盐水使动物免疫，该动物在15或18月龄时为进行淀粉样的负荷试验被杀死。图7说明，在18月龄，用Aβ42处理的小鼠表现出比PBS处理的18个月大对照动物(斑点负荷，4.7％)或者12月大的未经处理的动物(0.28％)明显低的平均淀粉样的斑点负荷(斑点负荷，0.01％)，如部分8的实施例XIII详细描述，其中斑点负荷通过图像分析测量。这些实验证明本发明治疗方法在减少患病个体的斑点负荷和预防斑点负荷发展很有效果。
按照本发明的这个方面，治疗剂源自于包含作为所研究疾病特征的斑点的原纤维肽或蛋白质。作为选择，从抗原的角度看，这样的药剂与这样的组分足够相似，可以诱导与原纤维组分交叉反应的免疫反应。表1和2提供了这样的原纤维肽和蛋白质的例子，其中组合物和序列在该领域是已知的，或可以按照本领域已知的方法方便地测定(见下面引用的参考文献和特别地讲授各种原纤维肽组分的提取方法和/或组合物的章节B2；另外的原纤维组分的例子描述如下)。
因此，按照本发明，以临床检查和/或活组织检查为基准，进行淀粉样蛋白病的诊断时，熟练的专业人员能够确定淀粉样沉淀的原纤维组成，并提供诱导针对原纤维肽或蛋白质的免疫反应的药剂。
例如，如上所述，用于治疗阿尔茨海默氏病或其他的以Aβ沉淀为特征的淀粉样疾病的治疗剂可以是任何天然存在的Aβ肽形式，特别是人类形式(即，Aβ39，Aβ40，Aβ41，Aβ42或Aβ43)。这些肽的序列及它们与APP前体的关系在本领域是已知的，并且在本领域为大家所熟知(例如，Hardy等，TINS 20，155-158(1997))。例如，Aβ42具有如下序列H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-Ile-Ala-OH.(SEQ ID NO1)Aβ41，Aβ40和Aβ39不同于Aβ42，它们分别在该肽C末端缺失Ala，Ala-Ile和AlaIle-Val。Aβ43不同于Aβ42，其在C末端存在苏氨酸残基。按照本发明优选方案，治疗剂会诱导针对所研究疾病的全部的或一部分原纤维组分的免疫反应。例如，优选的Aβ致免疫的组合物是诱导Aβ的游离N-末端的特异抗体的药剂。这样的组合物的优点是不能识别前体蛋白β-APP，从而较少可能产生自体免疫。
作为另外的例子，可以适当地用AA肽，血清淀粉样蛋白质(ApoSSA)的一种已知的8千道尔顿的片段，治疗如上所述的以AA原纤维沉淀为特征的疾病，例如，某些慢性炎症、慢性的局部或全身的微生物感染和恶性肿瘤。AA淀粉样疾病的例子包括，但是不局限于，炎症性的疾病例如类风湿性关节炎、少年慢性关节炎、僵硬性脊椎炎、牛皮癣、牛皮癣性关节病、瑞特氏综合征、成人斯蒂尔病、贝切特氏综合、克罗恩氏病，慢性微生物的感染例如麻疯病、肺结核、支气管扩张、褥疮、慢性肾盂肾炎、骨髓炎和惠普尔病，以及恶性肿瘤例如霍奇金氏淋巴瘤、肾癌、肠癌、肺癌、泌尿生殖道癌、皮肤基底细胞癌和毛细胞白血病。
AA肽指一个或多个源自淀粉样A血清前体蛋白(ApoSSA)的N-末端的肽，开始于前体蛋白的1，2或3残基，终止于残基58和84之间的任一点；通常AA原纤维由ApoSSA的1-76残基组成。按照在本领域众所周知的方法，可以测定精确的结构和组成，并合成适当的肽(Liepnieks，J.J.，Biochem.Biophys Acta 127081-86，1995)。
作为另外的例子，源自其中包含免疫球蛋白轻链(κ或λ链)的全部或一部分可变(V1)区域的N-末端区域的片段通常包含间叶组织中的淀粉样的沉淀，导致周围的和自发的神经病、腕管综合征、舌肥大、限制性心肌病、大关节关节病、免疫体液不调、骨髓瘤以及隐蔽的体液不调。本发明组合物优选地诱导针对一部分轻链的免疫反应，优选针对“新表位”减少可能的自身免疫作用，“新表位”是由于母体分子形成片段而形成的。
可使用本发明方法治疗各种遗传性淀粉样疾病。这样的疾病描述于上述章节B.2。例如，各种形式的家族性淀粉样多发性神经病起源于运甲状腺素蛋白(TTR)的至少五十种突变株形式，各自的特征为单一氨基酸变化，TTR是一种通过肝脏产生的14千道尔顿蛋白质。虽然许多这类疾病可根据它们特定的病状和/或人口统计起源区别，但是治疗组合物也可由诱导针对超过一个的TTR形式，如两个或更多包括野生型TTR的ATTR形式的混合物形式的免疫反应的药剂组成，以提供通用的治疗组合物。
含AapoAI的淀粉样沉淀在分子脱脂蛋白AI中具有点突变的人中发现。具有这种疾病形式的病人通常存在周围神经病或肾衰竭。按照本发明，治疗组合物由一个或多个本申请描述的或本领域已知的不同AapoAI形式组成。
某些家族形式的阿尔茨海默氏病，以及唐氏综合症，是β淀粉样的前体蛋白突变，导致具有主要由β淀粉样肽(Aβ)组成的原纤维斑点的沉淀的结果。如上文和本申请实施例所述，本发明治疗组合物中使用Aβ肽。
治疗上述遗传性类型的淀粉样变性的其他的剂型包括产生针对凝溶胶蛋白片段的免疫反应，以治疗遗传性的系统性淀粉样变性的组合物，产生针对溶菌酶蛋白质突变株(Ays)的免疫反应以治疗遗传性神经病，产生针对纤维蛋白原(AfibA)的突变株α链的免疫反应以治疗非神经形式的淀粉样变性如肾病，产生针对突变株抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C(Acys)的免疫反应以治疗冰岛报道的遗传性大脑血管病。另外，某些遗传性类型的蛋白感染素疾病(例如克雅氏症(CJD)、格-施-沙综合症(GSS)和致命性家族失眠(FFI))的特征为蛋白感染素蛋白质的突变株异构体，PrPSc。按照本发明，这种蛋白质可被用于治疗和预防PrP斑点沉淀的治疗组合物中。
如上所述，全身的或局部的淀粉样沉淀也与年龄增长有联系。根据本发明另外的方面，通过对敏感个体给用由与这样的年龄增长有关的一种或多种蛋白质组成的组合物，可以预防或治疗这样的沉淀。因此，由源自野生型TTR的ATTR组成的斑点经常地在老年人心脏组织中发现。同样地，某些年长的个体可能在他们的脑中生长无症状的原纤维局部沉淀；如本申请详细描述，Aβ肽治疗可以应用于这样的个体。β2微球蛋白是前列腺全部淀粉样蛋白的常见的组分，因此是本发明另外一种候选药剂。
作为另外的例子然而并非限制，本发明治疗方法可选择另一些非遗传性类型的淀粉样蛋白病。β2微球蛋白原纤维斑点通常生长于长期接受血液透析或腹膜透析的病人中。按照本发明，这样的病人可通过针对β2微球蛋白，或更优选针对其致免疫的表位的组合物治疗。
分泌激素的肿瘤可能也包含激素衍生的淀粉样的斑点，其组成通常为特别的内分泌器官的特征。因此这样的原纤维可能由多肽激素如降血钙素(甲状腺髓样癌)、胰岛淀粉样多肽(出现于大多数II型糖尿病患者中)和心钠素(分离的前房淀粉样变性)组成。本发明也设计了针对在主动脉内膜动脉粥样硬化中形成淀粉样沉淀的组合物。例如，Westermark等描述了一种形成这样的斑点的69个氨基酸的脱脂蛋白A的N-末端片段(Westermark等Am.J.Path.1471186-92，1995)；本发明治疗组合物包括针对这样的片段的免疫学的试剂以及该片段本身。
上述讨论集中在可以用作治疗或预防各种形式的淀粉样蛋白病的治疗药剂的原纤维组分上。该治疗剂也可以是包含诱导使用药物的人的相似的保护或治疗的免疫反应的表位的天然存在的或突变株原纤维肽或蛋白质的活性片段或类似物。致免疫的片段典型地具有至少3，5，6，10或20个邻近的来自天然肽的氨基酸的序列。示例性的Aβ肽致免疫的片段包括Aβ1-5，1-6，1-7，1-10，3-7，1-3，1-4，1-12，13-28，17-28，1-28，25-35，35-40和35-42。缺乏至少一种，以及有时至少5或10种存在于天然形式的原纤维组分中的C末端氨基酸片段用于某些方法中。例如，缺乏从Aβ43的C末端起的5个氨基酸的片段包括从AB的N-末端起的前38个氨基酸。在某些方法中优选从Aβ的N-末端一半起的片段。类似物包括等位的，特定的和诱导的变体。类似物经常由于存性置换，典型地在一个或一些位置不同于天然存在的肽。类似物典型地显示至少80或90％与天然肽相同的序列。某些类似物也包括非天然的氨基酸或N或C末端氨基酸修饰物。非天然的氨基酸的例子为α，α-二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、γ-N，N，N-三甲基赖氨酸、γ-N-乙酰基赖氨酸、O-磷酸基丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和ω-N-甲基精氨酸。
通常，本领域的专业人员能够理解可以按照如下所述的与天然存在的原纤维组分的交叉活性和/或在转基因动物中的预防或治疗效能，筛选按照本发明该方面的片段和类似物。如果它们的免疫活性和动物模型效果大致相当于或大于淀粉样的原纤维组分相应的参数，这样的片段或类似物可用于本发明的治疗组合物。
这样的肽，蛋白质或片段，类似物及其他淀粉样变性肽，可以按照本领域众所周知的标准方法，通过固相肽合成或重组体表达合成，或可以从天然源中获得。通过引用许多参考文献并结合对特定的原纤维组分的描述，提供了典型的原纤维组合物、原纤维提取方法及原纤维肽或蛋白质组分的序列。另外，其他的组合物、序列提取和测定的方法在本领域是已知的，需要制造和使用这样的组合物的人可以采用它们。肽自动合成仪可用来制造这样的组合物，它可在市场上从许多制造商，如Applied Biosystems(Perkin Elmer；Foster City，California)买到，制备合成肽的方法在本领域是已知的。可以在细菌如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞内进行重组体表达；作为选择，可以在本领域已知的体外转译系统中用自由细胞制造蛋白质。重组体表达方法描述于Sambrook等，分子克隆(Molecular Cloning)A LaboratoryManual (C.S.H.P.Press，NY 2d ed.，1989)。某些肽和蛋白质也是可以买到的；例如，从供应商如美国肽公司(American Peptides Company，Inc.)，Sunnyvale，California，和Califomia Peptide Research，Inc.Napa，California可买到某种形式的Aβ肽。
治疗剂也可以由更长的多肽组成，多肽包括例如，活性肽原纤维片段或类似物，和其他的氨基酸。例如，Aβ肽可以是完整的APP蛋白质或其部分，如从Aβ的N-末端开始延伸至APP末端的C-100片段。这样的多肽可以在如下所述动物模型中筛选预防或治疗效能。Aβ肽、类似物、活性的片段或其他的多肽可以协作方式给药(即，作为一种淀粉样的肽)或以分离形成给药。治疗剂也可以包括单体致免疫药剂或结合体或载体蛋白质的多聚体，和/或如上所述，可以被加到其他的原纤维组分中，以提供大范围的抗淀粉样斑点的活性。
在进一步的变化中，致免疫的肽，如Aβ片段，可以作为致免疫的组合物的一部分被病毒或细菌表达。一个编码致免疫肽的核酸被合入到病毒或细菌的基因组或游离基因中。选择性地，核酸以一种方式合入，使得致免疫的肽表达为分泌性蛋白质或具有病毒外表面蛋白质的融合蛋白或细菌跨膜蛋白质，以便显示肽。此类方法使用的病毒或细菌应该是非病源性的或被稀释的。适当的病毒包括腺病毒、HSV、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒及其他α病毒，水泡性口膜炎病毒及其他棒状病毒，牛痘和鸡痘。适当的细菌包括沙门氏菌和志贺氏菌属。致免疫的肽与HBV的HBsAg融合是特别适当的。治疗剂也包括未必具有与Aβ显著类似的氨基酸序列但可充当Aβ模拟物并诱导相似的免疫反应的肽和其他化合物。例如，任何形成β-折叠片的肽和蛋白质都可以用来筛选适用性。也可使用针对Aβ或其他淀粉样变性肽的单克隆抗体的抗特应抗体。这样的抗特应抗体摹拟抗原并产生对它的免疫反应(见《基础免疫学》(Essential Immunology)(Roit著，Blackwell ScientificPublications，Palo Alto，第6版)，p.181)。除Aβ肽以外的药剂应当诱导针对一个或多个上列的Aβ的优选的部分(例如，1-10，1-7，1-3，和3-7)的致免疫反应。优选地，此类药剂诱导特别针对特定片段而不针对Aβ的其他的部分的致免疫反应。
也可使用肽或其他化合物的随机文库来筛选适用性。可以制备组合文库以提供多种可通过逐步合成方式合成的化合物。这样的化合物包括多肽、β-转动模拟物、聚糖、磷脂、激素、前列腺素、类固醇、芳族化合物、杂环化合物、苯并二氮杂?、寡聚N-取代的甘氨酸和寡氨基甲酸酯。按Affymax，WO95/12608，Affymax，WO93/06121，哥伦比亚大学，WO94/08051，药典(Pharmacopeia)，WO95/35503和Scripps，WO95/30642(各自引作参考文献)描述的方法，化合物的大组合库可以通过编码合成库方法(ESL)构造。通过噬菌体展示方法也可产生肽库。请参见，例如，Deylin，WO91/18980。
通过测定与已知特异于Aβ或其他淀粉样变性肽如ATTR的抗体或淋巴细胞(B或T)结合的能力，开始筛选组合库和其他化合物的适用性。例如，最初的筛选可以用任何Aβ或其他所关心的淀粉样变性肽的多克隆的血清或单克隆抗体进行。然后将这样筛选后鉴定的化合物进行诱导Aβ或其他淀粉样变性肽抗体或反应性淋巴细胞能力的进一步分析。例如，可以在已经预涂原纤维肽的微量滴定板上试验血清的多倍稀释物，可以进行对Aβ的反应性抗体的标准ELISA试验。然后按实施例所述，用预先具有淀粉样变性疾病倾向的转基因动物试验化合物的预防和治疗效能。这样的动物包括，例如，Games等，同上中描述的具有APP的717突变的小鼠，Mc Conlogue等，US5,612,486和Hsiao等，Science 274，99(1996)；Staufenbiel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94，13287-13292(1997)；Sturchler-Pierrat等，Proc.Nati.Acad.Sci.USA94，13287-13292(1997)；Borchelt等，Neuron 19，939-945(1997)中描述的具有APP的670/671 Swedish突变的小鼠。相同筛选方法可以应用于其他的潜在的药剂如上面描述的Aβ片段，Aβ类似物和包括Aβ在内的比较长的肽。b.其他的斑点组分能够理解针对其他淀粉样的斑点组分的免疫反应也可有效预防、延迟或减少淀粉样的疾病中的斑点沉淀。这样的组分可能是斑点中原纤维的或与原纤维有关的或形成原纤维的较少的组分，值得说明的一点是，那些组分遍及体内，或对淀粉样的沉淀相对非特异性，通常不太适用于治疗的目标。
因此本发明进一步发现，那些诱导特异斑点组分的免疫反应的药剂可应用于治疗或预防淀粉样疾病的发展。本部分提供若干典型的与淀粉样的斑点有关的分子的背景。按照本发明，诱导针对所有这些分子的免疫反应独自或与针对上述的原纤维组分或针对下述的所有不形成原纤维的组分的药物组合物结合，就提供了另一种抗淀粉样变性的治疗方案。如此处所述，依据这样的斑点组分的被动免疫方案也是本发明的组成部分。
例如，合成核素是在结构上类似于脱脂蛋白，但是是在神经元细胞溶质，特别是在突触前末端附近发现的蛋白质。至少有三种形式的该蛋白质，称为α，β和γ合成核素。最近已经发现α和β合成核素包含于某些淀粉样疾病，特别是阿尔茨海默氏病中的淀粉样沉淀的核中(Clayton，D.F.等，TINS 21(6)249-255，1998)。更具体地说，α和β合成核素的NAC区域的片段(残基61-95)已经从阿尔茨海默氏病人的淀粉样斑点中分离得到；事实上这些片段组成约10％该斑点，其在用十二烷基硫酸钠(SDS)增溶之后仍不能溶解(George，J.M.等Neurosci.News 112-17，1995)。此外，已经报道全长α合成核素和其NAC片段在体外促进β淀粉样肽集合体变成不能溶解的淀粉样蛋白(Clayton，同上)。
与淀粉样斑点有关的其他组分包括非肽组分。例如，基底膜聚糖和基底膜聚糖衍生的氨基多糖是存在于包含Aβ的阿尔茨海默氏病及其他CNS和全身淀粉样变性中的淀粉样斑点，包括与糖尿病有关的糊精斑点中的大型硫酸肝素含蛋白多糖。这些化合物已经显示增强Aβ原纤维的形成。核心蛋白质和基底膜聚糖的氨基多糖链已经显示参与与Aβ的结合。另外的氨基多糖，特别是硫酸皮肤素、软骨素-4-硫酸酯和戊聚糖多硫酸酯通常发现于各种型式的淀粉样斑点中，也显示增强原纤维的形成。葡聚糖硫酸酯也具有这些性质。当这些分子脱硫酸酯后，增强显著减少。针对硫酸酯形式的氨基葡聚糖，包括氨基葡聚糖本身的致免疫治疗形成本发明的另一个实施方案，作为初级或二级处理。本领域普通的技术人员完全可以制备这样的分子以及包含这样的分子的适当的治疗组合物。2.诱导被动免疫反应的药剂本发明治疗剂也包括免疫的试剂，如抗体，特别是与原纤维肽或淀粉样的斑点的其他的组分结合的抗体。这样的抗体可以是单克隆的或多克隆的，以及具有结合专一性的，即与目标淀粉样蛋白病种类一致。治疗组合物和治疗方案可以包括针对斑点特定的原纤维或非原纤维组分上的单一结合区域或表位的抗体，或可以包括针对两个或更多相同组分上的表位或斑点的多个组分上的表位的抗体。
例如，在支持本发明进行的实验中，对81/2至101/2个月大的PDAPP小鼠腹膜内(i.p.)注射针对Aβ肽特异的表位制备的抗Aβ42多克隆抗体或抗Aβ单克隆抗体或盐水，详见本申请实施例XI。在这些实验中，监视循环抗体浓度，按需要加强注射以维持制备抗体的特异的抗原的循环抗体浓度大于1∶1000。与对照组相比，抗体治疗的小鼠的皮质、海马体和小脑区域总的Aβ水平减少；减少最高的出现在用多克隆抗体处理的小鼠中。
在进行的支持本发明进行的另外的实验中，一种预测性的体内试验(实施例XIV)用来试验针对称为NAC的合成核素片段的抗体的清除。已经证明合成核素为与淀粉样的斑点有关的蛋白质。NAC抗体与包含淀粉样的斑点和小神经胶质的细胞的脑组织样品接触。兔血清用作对照。随后的监视显示斑点的数目和大小显著地下降，表现出清除抗体的活性。
数据显示，通过使用有效减少淀粉样的斑点负荷的针对Aβ肽表位或针对合成核素NAC片段的免疫试剂可以大大地减少与阿尔茨海默氏病及其他淀粉样的疾病有关的淀粉样的斑点负荷。显然各式各样的抗体可被用于这样的组合物中。那些与集合形式的Aβ特异结合而不与分离形式结合的抗体及那些与分离形式特异结合而不与集合形式结合的抗体都适用于本发明。其他适当的抗体为与集合和分离形式都结合的抗体。某些这样的抗体与短形式的天然存在的Aβ(即，Aβ39，40或41)结合，而不与长形式的天然存在的Aβ(即，Aβ42和Aβ43)结合。某些抗体与长形式结合而不与短形式结合。某些抗体与Aβ结合而不与全长的淀粉样前体蛋白结合。某些抗体与Aβ结合的亲合力大于或等于约106，107，108，109或1010M-1。
多克隆的血清典型地包含沿Aβ长度与若干表位结合起来的混合抗体群。单克隆抗体与Aβ中的特定的表位结合，这些表位可以是构象的或非构象的表位。某些单克隆抗体与Aβ残基1-28中的表位结合(将天然的Aβ的第一个N末端残基指定为1)。其他的单克隆抗体与具有Aβ的残基1-10的表位结合。还有单克隆抗体与具有Aβ的残基1-16的表位结合。其他的单克隆抗体与Aβ的残基1-25的表位结合。某些单克隆抗体与Aβ的氨基酸1-5，5-10，10-15，15-20，25-30，10-20，20，30或10-25中的表位结合。抗体预防和治疗效能的试验可以使用实施例描述的转基因动物模型方法。
更一般来说，从本申请提供的信息，专业人员可以可使用本申请描述的组合物设计，生产和试验针对原纤维蛋白质或其他的淀粉样的疾病的特性肽，以及针对其他的淀粉样组分的抗体，其中疾病如本申请章节2描述。a.免疫球蛋白的一般特性已知碱性的抗体结构单元包含子单元的四聚体。各四聚体由两个相同的多肽链对组成，每对均具有一个“轻链”(约25kDa)和一个“重链”(约5-70kDa)。各链氨基末端部分包括主要担负抗原识别的约100到110或更多氨基酸的可变区。各链羧基末端部分为主要担负效应子功能的恒定区。
轻链分为κ或λ。重链分为γ，μ，α，δ或者ξ，分别地定义为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE抗体的同种型。轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12或更多氨基酸的“J”区相连，重链也包括约10或更多氨基酸的“D”区。(通常参见，《基础免疫学》(FundamentalImmunology)(Paul，W.等，第2版。Raven Press，N.Y.，1989)，第7章(全部作为参考文献)。
各轻/重链对的可变区形成抗体结合部位。因此，一个完整的抗体具有两个结合部位。除了双官能的或双特异的抗体，两个结合部位是相同的。所有链表现出相同的通用结构的相对稳定的构架区(FR)，它通过三个高变区连接，也被叫作互补性测定区或CDRs。各对的两个链的CDRs通过构架区定位，启动与特定的表位的结合。从N-末端到C-末端，轻链和重链都包含区域FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。各区域氨基酸的分配与Kabat的免疫有义的蛋白序列(SequencesOf Proteins of lmmunological Interest)(国家健康研究院NationalInstitutes of Health，Bethesda，MD，1987和1991)，或Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196901-917(1987)；Chothia等，Nature 342878-883的定义一致。b.非人类抗体的制备非人类，例如，鼠科动物、豚鼠、兔或大鼠的单克隆抗体的生产可以通过，例如，用斑点组分，如Aβ或其他原纤维组分使动物免疫来完成。也可使用包括Aβ或Aβ的致免疫的片段或Aβ抗体的抗特应抗体的更长的多肽。参见例如，Harlow和Lane，抗体(Antibodies)，实验手册(A Laboratory Manual)(CSHP NY，1988)(均引作参考)。这样的免疫原可以通过肽合成或通过重组体表达从天然来源中获得。如下所述，该免疫原可以选择性地与载体蛋白融合或者复合给药。选择性地，该免疫原可以用辅剂给药。如可使用几种类型的辅剂。对于免疫接种实验动物，优选完全弗氏佐剂，然后是不完全佐剂。兔或豚鼠典型地被用来制造多克隆的抗体。小鼠典型地被用来制造单克隆抗体。筛选与该免疫原特异性结合的抗体。选择性地，进一步筛选抗体以与该抗原的特定区域结合。例如，当Aβ肽作为免疫原时，通过测定抗体与Aβ肽缺失突变体的集合的结合和测定与该抗体结合的缺失突变体可完成筛选。结合可以通过例如蛋白质印迹或ELISA评定。显示与该抗体特异结合的最小的片段限定该抗体的表位。选择性地，通过竞争试验可以测定表位的专一性，该试验中试验抗体与基准抗体竞争性地与组分结合。如果试验和基准抗体竞争，则它们与相同表位或十分近接的表位结合，两种表位十分接近的情况是，结合一种抗体会干扰与另一个抗体的结合。c.嵌合抗体和人源化抗体嵌合的和人源化的抗体与为其提供原料的小鼠或其他的非人类的抗体具有相同或相似的结合专一性和亲合力。嵌合抗体是其轻链或重链基因典型地通过遗传工程从属于不同种类的免疫球蛋白基因构造的抗体。例如，小鼠单克隆抗体基因的可变的(V)片段可以结合到人类常量(C)片段，如IgG1和IgG4上。因此，典型的嵌合抗体为由小鼠抗体的V或抗原结合区域组成的杂化蛋白或从人类抗体来的C或效应子区域。
人源化的抗体具有实质上来自人类抗体(称为受体抗体)的可变区骨架残基和实质上来自小鼠抗体(称为受体免疫球蛋白)的互补性测定区。见Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029-10033(1989)和WO 90/07861，US 5,693,762，US 5,693,761，US 5,585,089，US 5,530,101和Winter，US 5,225,539(均引作参考)。如果恒定区(s)存在，它实质上或完全来自人免疫球蛋白。人类可变区域通常选自其骨架序列与衍生CDRs的鼠科动物可变区域高度相同的人类抗体。重链和轻链可变区骨架残基源自于相同或不同的人类抗体序列。人类抗体序列可以是天然存在的人类抗体的序列也可以是若干人类抗体的共有序列。参见Carter等，WO92/22653。基于他们对CDR构象和/或与抗原的结合的可能的影响，选择某些人类可变区骨架残基的氨基酸用于替换。通过建立模型、检测该氨基酸在具体地点的特征或特殊的氨基酸的替代效应或诱变的经验观测，研究这些可能的影响。
例如，当鼠科动物可变区骨架残基和选择的人类可变区骨架残基的氨基酸不同时，该人类骨架氨基酸通常由相当于来自小鼠抗体的骨架氨基酸代替，该氨基酸适当地(1)直接地与抗原非共价结合，(2)与CDR区邻接，(3)否则与C