专利名称：肿瘤治疗型人肝素酶map疫苗的制作方法随着免疫学的发展我们认识到CD8+T淋巴细胞识别靶抗原并非识别抗原的全长 序列，而是识别抗原中一段8-11个氨基酸构成的多肽，这一段被CD8+T淋巴细胞识别的氨 基酸序列称为CTL表位。肝素酶是1999年由四个不同的实验室克隆成功的一种肿瘤转移相关基因。其表 达产物内β-D-葡糖糖苷酶能特异性识别、切断硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)的硫酸肝素(HS) 侧链。而HSPG是细胞外基质(ECM)和基底膜(BM)的主要成分，在组织构成、血管形成和细 胞粘附等诸多方面发挥着极其重要的生理作用。高度水化的HS侧链极其带有的负电荷形 成结构致密的选择性分子筛，是阻止肿瘤细胞侵袭扩散的首要屏障之一，而且伸展的HS侧 链还储备着大量的生长因子、趋化因子和酶类等生物大分子物质。肝素酶促进肿瘤转移的 主要机制在于⑴通过降解HSPG途径破坏ECM、BM的完整性，使膜的屏障功能减退，利于 肿瘤细胞的浸润及转移；( 促进肿瘤血管生成。肝素酶可通过直接、间接两种方式发挥促 血管生成作用。一方面肝素酶可直接作用于内皮细胞以出芽方式促进血管生成，另一方面， bFGF作为最强的血管生成诱导因子，平时以无活性形式与乙酰肝素结合贮存于ECM中，当 HSPG被肝素酶裂解时，可将结合的有高度活性的HS-bFGF复合物从微环境中释放出来，间 接诱发血管生成反应。此外，另一种被固化在HSPG上的血管生成因子，即血管内皮生长因 子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，在肝素酶裂解HSPG的过程中也得到释 放并被激活，与bFBF共同诱导肿瘤血管生成，在肿瘤的生长转移中，新生血管的生成为转 移的肿瘤提供了非常便利的物质基础和通道。我们既往的研究表明，肝素酶mRNA的表达水 平与胃癌的生长、浸润及转移密切相关。体外研究发现不同转移潜能的乳腺癌细胞株其肝 素酶基因表达是不同的，低转移细胞株检测不到肝素酶mRNA的表达和蛋白活性，而高转移 细胞株中肝素酶大量表达。将肝素酶全长cDNA转染至低转移潜能的小鼠淋巴细胞瘤和黑 色素瘤细胞株后，肿瘤细胞的转移潜能明显增强，而肝素酶抑制剂PI88、硫酸昆布多糖或者 反义分子则能明显降低肿瘤细胞的转移能力。在此研究的基础上，我们将肝素酶全长基因序列构建到pDC-315腺病毒载体上， 该病毒疫苗能在体外诱导肝素酶特异性的CTL反应，杀伤肝素酶阳性并且HLA-A匹配的胃 癌细胞株。但是病毒疫苗具有其危险性，病毒的基因序列可能整合到正常细胞，而且这种整 合无法控制，其安全性差，所以病毒疫苗目前极少应用于临床。而通过以上研究我们可以判 定，在肝素酶全长序列中肯定存在CTL表位，并且这种表位被抗原递呈细胞(APC)递呈后能 诱导特异性的抗肿瘤免疫效应。德国学者预测并鉴定了三条肝素酶表位，能诱导CTL杀伤肝素酶阳性的乳腺癌细胞，并申请了专利。但是9肽疫苗具有其致命的弱点分子量小、抗原性弱、在体内非常容易 被降解因而半衰期太短无法诱导有效的CTL反应，达到诱导机体产生抗肿瘤免疫效应的目 的。
本发明的目的是提供一种肝素酶表位多抗原肽疫苗，通过改造该肝素酶CTL表位 疫苗的结构，使其分子量增大、稳定性增强、在体内半衰期延长，以增强其抗原性，以达到在 体内不易被降解，有充足的时间与抗原递呈细胞接触，被抗原递呈细胞递呈而达到诱导机 体产生特异性的抗肿瘤免疫效应。本发明的另一目的是提供所述肝素酶表位多抗原肽疫苗(MAP)在制备临床治疗 和检测肿瘤相关疾病得药物或疫苗中的应用。本发明根据Tam实验室提出的多抗原肽(multiple antigen ρ印tides, MAP)的 设计方案采用分子量小且免疫原性弱的赖氨酸为核心基质，将其与肝素酶CTL表位多肽耦 联在一起，形成树枝样结构，这种设计模式在加强了抗原优势表位的肽链结构特异性的同 时，还增大了抗原的分子质量，不仅很好的模拟了天然表位的空间构象，而且还不需要再耦 联载体蛋白就能诱生较强的免疫反应，在疫苗的研发和肿瘤免疫治疗上具有重大的应用前 景，这种MAP疫苗的设计原理不仅适用于T细胞表位，而且亦适用于B细胞表位。这样改 造后肝素酶表位的抗原性、稳定性均得到大幅度的提高，而且在体外容易合成，方便临床应 用。我们既往的研究表明，肝素酶mRNA的表达水平与胃癌的生长、浸润及转移密切相 关，在此研究基础上，我们将肝素酶全长基因序列构建到PDC-315腺病毒载体，并感染树突 状细胞，研究结果表明负载了肝素酶PDC-315腺病毒的树突状细胞能有效地诱导CTL反应， 产生肝素酶特异性的抗肿瘤免疫效应。根据以上研究结果我们进一步预测并鉴定了 3条人 肝素酶表位及2条小鼠肝素酶表位，研究结果提示肝素酶表位能在体内外诱导CTL反应，产 生肝素酶特异性的抗肿瘤效应。但是，肝素酶CTL表位疫苗具有致命的弱点，就是其分子量 小、抗原性弱、半衰期短。为了克服表位单肽疫苗的弱点，为实现本发明第一目的而采用的技术方案是这样 的，即一种能与人类HLA-A2. 1分子结合，诱导CTL反应的多抗原肽(MAP)疫苗，包括筛选自 序列号为SEQ NO 1的人肝素酶的CTL多肽表位，并且经过MAP设计用分子量小且免疫原性 弱的赖氨酸为核心基质，与所述肝素酶CTL表位多肽耦联在一起，形成树枝样结构的以下氨基酸序列SEQ NO.2，AKLFSKLMK--MAP4SEQ NO.3，LKKFLLSLff--MAP4SEQ NO.4，VFFSYSFAP--MAP4SEQ NO.5,KPSGLLIL—-MAP4SEQ NO.6,MLVKTGVKL--MAP4SEQ NO.7，LGLKDLWMF--MAP4SEQ NO.8,LPDFNEDVL--MAP4SEQ NO.9,VSLFSPSVL--MAP404与本发明有关的多肽序列，可通过任何已有的体外多肽合成设备和不同技术原理 人工合成。例如通过原核或真核表位纯化获得，或者人工合成。其获得的方法主要由以下 步骤，包括多肽的合成、纯化以及最后的产品的收集。这些技术已经成熟并程式化，在相关 领域被广泛应用。本发明所述的多抗原肽(MAP)疫苗还包括疫苗所采用的医用辅料例如疫苗采用的 佐剂、本发明的积极效果本发明使用全新的多肽疫苗改造技术，对肝素酶表位多肽疫苗进 行改造，克服多肽疫苗抗分子量小、原性弱的缺点，将多肽疫苗制备成树枝样结构，大大提 升了多肽疫苗的稳定性和抗原性，更加容易诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫效应，在中 晚期肿瘤的治疗中具有非常重要的意义。因此具有非常重大的商业产业化价值。

图 1 为 SEQ NO. 2，AKLFSKLMK — MAP4 的树枝样结构图； 图2为SEQ NO. 3，LKKFLLSLff-MAP4的树枝样结构图3为SEQ NO. 4，VFFSYSFAP—MAP4的树枝样结构图4为SEQ NO. 5，KPSGLLIL—MAP4的树枝样结构图5为SEQ NO. 6，VSSIFIDLV—MAP4的树枝样结构图6为SEQ N0. 7，LGLKDLWMF—MAP4的树枝样结构图7为SEQ N0. 8，LPDFNEDVL—MAP4的树枝样结构图8为SEQ N0. 9，VSLFSPSVL—MAP4的树枝样结构图9为合成的SEQ NO. 2, AKLFSKLMK—MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图10为合成的SEQNO.3LKKFLLSLff--MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图11为合成的SEQNO.4VFFSYSFAP--MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图12为合成的SEQNO.5，KPSGLLIL—MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图13为合成的SEQNO.6，VSSIFIDLV--MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图14为合成的SEQNO.7,LGLKDLWMF--MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图15为合成的SEQNO.8，LPDFNEDVL--MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图16为合成的SEQNO.9，VSLFSPSVL--MAP4多肽疫苗的高压液相色谱分析图；图17为合成的SEQNO.2，AKLFSKLMK--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图18为合成的SEQNO.3LKKFLLSLff--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图19为合成的SEQNO.4VFFSYSFAP--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图20为合成的SEQNO.5KPSGLLIL—-MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图21为合成的SEQNO.6VSSIFIDLV--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图22为合成的SEQNO.7LGLKDLWMF--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图23为合成的SEQNO.8LPDFNEDVL--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图24为合成的SEQNO.9VSLFSPSVL--MAP4多肽疫苗的质谱分析图；图2E为 SEQ N0.4，VFFSYSFAP——MAP4、SEQ N0. 3，LKKFLLSLff-MAP4
N0.，4，VFFSYSFAP—MAP4多肽疫苗体内外诱导的效应细胞对来源于不同组织器官的肿瘤细 胞的杀伤效应；图 26 为 SEQ NO. 4，VFFSYSFAP—MAP4、SEQ NO. 3，LKKFLLSLW—MAP4、SEQ NO.，4，VFFSYSFAP—MAP4多肽疫苗体内外诱导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效应的特异 性研究以及多肽疫苗体内外诱导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤效应的HLA-A2. 1限制性研 究；
图27肝素酶MAP疫苗诱导机体产生的INF-Y分泌示意图。

多肽的合成在美国PE公司生产的ABI431A型多肽合成仪上进行，简述如下采用标准 Fmoc方案，精氨酸采用两次偶联，按照多肽序列从羧基端向氨基端延伸。多肽合成后，采用 相应的切割酶进行切割，同时去除多种保护的多肽粗产品。在_20°C条件下储存、备用。(2) 肝素酶MAP表位的纯化和分子量分析
将上述实施实例获得的多肽MAP表位通过RP-HPLC纯化和分析将合成的MAP4表位疫 苗用DMSO溶解，浓度为20mg/ml，经0. 22 μ m纤维膜过滤后，在美国Waters公司产品Delta 600型HPLC上纯化和进行纯度分析。流动相选用换0. 1%TFA的乙氰溶液。各肽的纯化选用 C18分析柱(美国Waters公司，7. 0 μ m，100A, 7. 8mmX 150mm)，各肽的纯度分析选用C18分 析柱(美国Waters公司，5. 0 μ m，100A, 3. 9mmX 150mm)。各纯化后的多肽的相对分子量测 定啊API2000型(美国Waters公司)质谱仪上按常规方法进行。其HPLC纯度分析及质谱 分析图参见图4至图9，可以看出3条肝素酶MAP4多抗原肽的理论值与实际测量值吻合，且 纯度均在95%以上，说明合成效果好，可以用于下一步的研究。(3)多肽产品的收集
纯化上述肝素酶MAP4多抗原肽疫苗通过收集液在常温下减压干燥至l_2ml后用至少 50ml预冷后的乙醚沉淀，G6玻砂漏斗过滤收集沉淀，再次完全真空干燥，所得的便是肝素 酶MAP4多肽纯品，-70°C条件下储存、备用。实例2本发明肝素酶MAP4疫苗的抗肿瘤效应研究 采用标准4h 51Cr释放法进行
① 效应细胞的准备从HLA-A2阳性健康献血者的PBMC细胞中分离DC细胞，分别 加入30 μ mol/L的肝素酶抗原肽，常规制备效应细胞。② 靶细胞的准备ΚΑΤ0- III胃癌细胞(Hpa+，HLA-A2+)、U20S骨肉瘤细胞 (Hpa+, HLA-A2+)、SW480结肠癌细胞(Hpa+，HLA-A2+)为本室常规培养冻存制备。③ CTL活性的检测按不同的效应/靶细胞比例，采用51Cr释放法检测测CTL 活性
效应细胞特异性杀伤效率按照如下公式计算
效应细胞对靶细胞的杀伤效应见图25.
实例3本发明肝素酶MAP4疫苗抗肿瘤的肝素酶特异性研究采用标准4h 51Cr释放法进行
①效应细胞准备同上
②靶细胞准备MCF-7乳腺癌细胞(Hpa—，HLA-A2+)、转染了肝素酶基因的MCF-7 乳腺癌细胞(MCF-7/Hpa)由本研究所制备。IfepG2肝癌细胞(Hpa+，HLA-A2. Irp)、转染了 HLA-A2. 1 基因的 H印G2 肝癌细胞(H印G2/HLA-A2. 1) (Hpa+, HLA-A2+)。③ 采用51Cr释放法检测效应细胞对肝素酶阴性的靶细胞的杀伤效应的检测， 然后对肝素酶阴性的靶细胞转染肝素酶全长基因序列，然后检测效应细胞对靶细胞的杀伤 效应。采用51Cr释放法检测效应细胞对HLA-A2. 1阴性而肝素酶阳性的的靶细胞的杀伤效 应，然后对肝素酶阳性而HLA-A2. 1阴性的靶细胞转染HLA-A2. 1全长基因序列，然后检测效 应细胞对靶细胞的杀伤效应(结果见图26)。实例4人肝素酶MAP疫苗能激发⑶4+淋巴细胞抗肿瘤免疫效应
用ELISP0T实验检测T细胞分泌IFN- γ，以证实肝素酶抗原肽负载的DC疫苗能够有 效刺激Th细胞的活化，诱导机体产生非特异性抗瘤效应。实验结果见图27显示以完成的 3条肝素酶MAP疫苗均能够有效刺激T淋巴细胞产生肝素酶特异的CTL细胞，分泌大量的 IFN- γ，而在去除CD4+ T细胞后，我们发现IFN- γ的分泌明显下降。而且，MAP疫苗刺激 机体产生的IFN-Y明显多于单链表位肽刺激机体产生的IFN-Y。提示肝素酶多肽疫苗不 仅能激发机体产生特异性的免疫杀伤效应，而且可以通过刺激IFN-Y等细胞因子释放促 进机体产生一个非特异性的抗肿瘤免疫反应(见图27 )。


本发明涉及肿瘤相关抗原肝素酶蛋白序列中，能诱导有效的抗肿瘤免疫效应的表位MAP疫苗，这种疫苗克服了单肽疫苗分子量小、抗原性弱的缺点，能诱导强烈的肝素酶特异性细胞毒性T淋巴细胞，对多种不同组织、器官来源的肝素酶阳性的肿瘤细胞产生杀灭效应，因此可以制备多肽疫苗用于中晚期肿瘤的治疗。