一种微生物转化制备度洛西汀手性中间体的方法

欧志敏, 沈文和, 车大庆

2012年8月22日

2011年2月21日

2011年2月21日

浙江九洲药业股份有限公司

C12R1/865GK102643879SQ20111004146

度洛西 手性 制备 微生物 转化

1.一种微生物转化制备度洛西汀手性中间体(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈的方法，其特征在于，所述方法以3-羰基-3-(2-噻吩基)丙腈为底物，以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂,进行转化反应制得所述(S)-3-轻基-3-(2-噻吩基)丙臆2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法为在pH5. (Γ8. O的磷酸盐缓冲液中，以3-羰基-3-(2-噻吩基)丙腈为底物，以酿酒酵母CGMCC No. 2266发酵获得的含酶菌体细胞为生物催化剂，于25 45°C下转化反应8 40小时，反应结束后，转化液经分离纯化得到所述(S)-3-轻基-3-(2-噻吩基)丙臆3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述3-羰基-3-(2-噻吩基)丙腈的初始浓度为 O. Γ1 mol/L4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述含酶菌体细胞用量以细胞干重计为Γ50 g/g 底物5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中还添加有终浓度为10 100 g/L的葡萄糖6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述含酶菌体细胞按照以下方法制备将酿酒酵母CGMCC No. 2266接种至发酵培养基中，摇床转速为150 200 r/min, 26^35 °C培养18^30 h，将发酵液离心，制得含酶菌体细胞7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离纯化的方法如下反应结束后，将转化液4000 r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈8.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法按照以下步骤进行 (1)斜面培养将酿酒酵母CGMCCNo. 2266接种到斜面培养基，26 35 °C培养4 6天得菌体斜面；所述的斜面培养基终浓度组成为麦芽汁5 15 g/L，酵母粉2 4 g/L，蛋白胨4 6 g/L，葡萄糖7 12 g/L，琼脂15 25 g/L,自然pH值，溶剂为水； (2)种子培养从菌体斜面取一接种环菌体转接到种子培养基，26 35°C，摇床转速为150^200 r/min，培养18 26 h得种子液；所述的种子培养基终浓度组成为葡萄糖26 32g/L，酵母粉 2 4 g/L，硫酸铵 3 6 g/L，无水 MgSO4 O. 2 O. 4 g/L, K2HPO4 · 3H20 O. 5 I. 5g/L, KH2PO4 O. 6 I. 5 g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水； (3)发酵培养取种子液，以体积比1(Γ20%的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为26 35 °C，摇床转速为15(T200 r/min，培养18 30 h得到含有含酶菌体细胞的发酵液，离心分离得到所述含酶菌体细胞；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖26 32 g/L，酵母粉2 4 g/L，硫酸铵 3 6 g/L，无水MgSO4 O. 2 O. 4 g/L，K2HPO4 ·3Η20 O. 5 I. 5 g/L, KH2PO4O. 6 I. 5 g/L,用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7. 0，溶剂为水； (4)生物转化在pH5. (Γ8. O的磷酸盐缓冲液中，加入O. Γ1 mol/L的3-羰基-3-(2-噻吩基)丙腈，再添加终浓度IiTlOO g/L的葡萄糖作为辅助底物，以及细胞干重为3-羰基-3-(2-噻吩基)丙腈f 50倍的含酶菌体细胞，于25 45 °C下转化反应8 40小时，反应结束制得转化液； (5)分离纯化反应结束后将转化液4000r/min离心20分钟，弃去菌体沉淀，将上清液用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-3-羟基-3-(2-噻吩基)丙腈

本发明属于微生物转化领域，具体涉及一种利用微生物转化制备度洛西汀手性中间体(S) _3_轻基_3_ (2_噻吩基)丙臆的方法