专利名称：一种筛选高效降解茶籽饼粕的微生物菌株的方法油茶是我国南方丘陵地区一种重要的油料作物，占全国木本食用油料作物的80% 以上。茶籽饼，又称茶粕，别名茶麸、茶枯，茶籽饼。呈紫褐色颗粒，是野山茶油果实榨油后剩下的残渣。茶籽经榨油后的饼粕中还含有大量的淀粉、蛋白质、粗脂肪、可溶性糖和茶皂素等，可以再提取利用。我国油茶林面积约400万公顷，是世界上油茶品种最多、分布最广、产量最多的国家。据统计，我国采摘茶园面积约为100万公顷，我国近年来年产油茶茶籽约55万吨，油茶茶籽含油率为沈% 39%，按机榨得油率70%计算，油茶饼粕年均产量约40 万吨。我国油茶林主要分布在湖南、江西、广西三省，三省油茶茶籽产量占全国的80%以上。我国油茶茶籽粕和茶叶茶籽粕产量约为70万吨，由此可见，我国潜在的可利用茶粕资源十分丰富。茶油茶饼粕一般含有7%的粗脂肪，149Γ15%的粗蛋白质，33%的粗纤维，40%多的糖类，茶皂素约129Γ18%，是潜在的可利用的茶籽残渣资源。因而，开发利用茶籽粕具有较高的经济效益。目前，茶籽主要采用传统的压榨法榨油工艺制油，所生产的茶粕中茶皂素、单宁等抗营养因子含量过高，不适宜直接用于动物饲料的生产，大部分被用作清塘剂、 肥料、燃料，少量用于茶皂素的提取。同时，因茶籽饼粕中含有109Γ15%溶血性茶皂素，而茶皂素的存在使饲料味苦且辛辣，并对鱼类等水生动物有很强的毒性，因此，限制了其在饲料工业中的应用。但是，如果茶粕去除了有毒物质茶皂素，其营养价值可与米糠媲美，且经过微生物发酵后，可得到较高的菌体蛋白，不仅可以提高茶粕的利用价值，且可通过降解菌发酵使之成为一种较好的饲料资源目前对茶籽饼粕降解的研究还比较薄弱，代表性的研究有肖玉娟等以提取茶皂素后的茶粕为材料，研究ctmm(粗壮脉纹胞菌)降解茶粕培养基的粗纤维；李君君等通过刚果红培养基、羧甲基纤维素培养基等培养基纤维素酶获得6株菌种纤维素酶产生菌；田璨熙等从自然界中筛选得到一株能有效降解具有较强抑菌作用的茶籽饼的菌株T7。 专利KR 20110090215公开了一种具有确保清净性能佳、起泡好、对皮肤刺激性小、保湿效果好液体洗涤剂组合物，其中包括59Γ40%阴离子表面活性剂茶皂素，0. 5 20%非离子表面活性剂或两性表面活性剂，0.0广10%乳酸和皂素，剩余的尾水量此话不通。皂素从绿茶或皂荚中提取获得。专利W02011113221公开了一种由70% 80%柠檬油精、2% 10%茶皂素、 19Γ10%卵磷脂、29TlO%柠檬醛和0. 59Tl%柠檬酸组成的洗涤剂，该洗涤剂不损坏汽车、涂料膜和家电玻璃。美国专利US6007822公开了一种包含山茶属植物三萜皂苷的动物饲料组合物在人类和动物中具有提高免疫功能，增强抗菌和抗病毒活性，抗突变，抗氧化和清除自由基。专利CN1148598公开了一种提取精制茶皂素的方法，得到98%以上的固体茶皂素。 关于茶籽饼粕脱毒的报道更为鲜见，例如黄良柏先生在“脱毒茶粕残留茶皂素含量的测定方法比较” 一文中描述了一种茶籽饼粕脱毒的工艺，将脱脂茶粕浸提，固液分离，蒸发浓缩，喷雾干燥，分别获得饲料渣和茶皂素。该方法实质是提取茶皂素，附带性获得饲料渣，属于物理脱毒。但这些研究从茶籽饼粕的一个侧面来解决其中的一个问题，要么只是茶籽饼粕脱毒方面的研究，要么只是降解粗纤维方面的研究，要么只是降解粗蛋白方面的研究，缺乏系统性降解茶籽饼粕中的茶皂素、粗纤维和粗蛋白研究方法。
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种获得高效降解茶籽饼粕的微生物菌株的系统方法，该方法既包括茶籽饼粕脱毒，又包括茶籽饼粕粗纤维的降解，还包括茶籽饼粕粗蛋白的降解，是一种系统降解茶籽饼粕中的茶皂素、粗纤维和粗蛋白的方法。为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案包括以下几个步骤(1)高浓度茶皂素耐受菌株筛选配制高浓度茶籽饼粕固体培养基，其中茶籽饼粕 10% 15%，琼脂 1. 5% 2. 0%,水 85. 0% 90. 0%, pH 自然，12(Tl30°C灭菌 20 30 min,倒平板若干，每个平板按10倍稀释法涂布供试土样、或水样获茶籽饼粕废弃物样品稀释液0. 1 mL, 在30°C 40°C培养;Γ5 d，将菌落较大、涨势好的菌株转接斜面，获得茶皂素耐受菌株，编号，供进一步获得高蛋白酶活性菌株的筛选使用。⑵高蛋白酶活性菌株筛选配制干酪素固体培养基，其中干酪素1.09Γ2.0%， 0. 1 mol/L稀盐酸加热溶解后，葡萄糖2. 0% 4. 0%，琼脂1. 5% 2. 0%，用0. lmol/L氢氧化钠调pH至5. (Γ7. 0，其余为水，即用自来水定容至预订体积，12(Tl30°C灭菌20 30 min，倒平板若干。将上述发明技术方案⑴中得茶皂素耐受菌株，点接种于干酪素培养基上平板，在 300C 40°C培养纩3 d，将水解圈直径与菌落直径比值较大、涨势好的菌株再次转接无菌斜面，获得蛋白酶高活性菌株，编号，供进一步筛选高纤维素酶活性菌株的筛选使用。(3)高纤维素酶活性菌株筛选配制羧甲基纤维素固体培养基，其中羧甲基纤维素素1. 0% 2. 0%，自来水加热溶解后，蛋白胨0. 3% 0. 5%，琼脂1. 5% 2. 0%，自然pH，用自来水定容至预订体积，121°C灭菌25 30 min，倒平板若干。将上述发明技术方案⑵中得蛋白酶高活性菌株，点接种于羧甲基纤维素培养基上平板，在30°C 40°C培养2 3 d，用0. 19Γ0. 5%无菌刚果红液题染色5 min，再用2.09Γ5.0%无菌氯化钠溶液脱色5 min，选择水解圈直径与菌落直径比值较大、涨势好的菌株再次转接无菌斜面，获得纤维素酶高活性菌株若干，并编号，4°C冰箱保存、备用。(4)摇瓶发酵降解茶籽饼粕进一步复筛将所述的上述发明技术方案⑶中得茶皂素高耐受性、高蛋白酶活性以及高纤维素酶活性菌株，用于摇瓶发酵降解茶籽饼粕进一步复筛。其中，培养基按重量百分比取茶籽饼粕29Γ5%，含水重量为959Γ98%，ρΗ自然，100 mL 若干瓶，置于250 mL三角瓶，12(T130°C灭菌20 30 min，分别接种上述发明技术方案⑶获得菌株，2(ΚΓ300 r/min条件下，摇床振荡培养72、4 h，测定发酵液中茶皂素含量、游离氨基酸含量、还原糖含量、粗蛋白降解率、粗纤维降解率、蛋白酶活力、纤维素酶活力，选择茶皂素含量低、游离氨基酸含量高、还原糖含量高、粗蛋白降解率高、粗纤维降解率高、蛋白酶活力高、纤维素酶活力高的菌株，编号，作为茶籽饼粕发酵的生产菌种，4°C冰箱保存、备用。(5)茶籽饼粕发酵降解①菌种制备按重量百分比取茶籽饼粕29Γ5%、麸皮1%1%，含水重量为939Γ97%，ρΗ自然，12(Tl3(TC灭菌2(T30 min，接种上述发明技术方案⑷获得若干菌株，200 300r/min条件下，摇床振荡培养使该种子培养液中菌体浓度达到10『109 cfu/mL，作为茶籽饼粕发酵的生产菌种；②茶籽饼粕固体发酵降解按重量百分比取茶籽饼粕409Γ50%、含水重量为50%飞0%， 12(T130°C灭菌3(T40 min制成茶籽饼粕固体发酵培养基；再接种上述发明技术方案①获得生产菌种以19Γ3%的接种重量接种到该茶籽饼粕固体发酵培养基中，混合均勻，堆积成高0. 5^0. 8 m,长度宽度不限的垄堆，上面覆盖草帘，45 55°C下发酵5 10天，干燥后即得脱毒且降解了的固体茶籽饼粕；③茶籽饼粕液体发酵降解按重量百分比取茶籽饼粕109Γ15%、含水重量为859Γ90%， 于100广1000 L发酵罐中，12(T130°C灭菌30 40 min制成茶籽饼粕液体发酵培养基；再将步骤①获得生产菌种以1。/。 3。/。的接种重量接种到装有该茶籽饼粕液体发酵罐中，32 37°C 下通风发酵4飞天，浓缩后即得脱毒且降解了的茶籽饼粕水解液。与现有技术相比，本发明具有以下优点
⑴在本发明方法的微生物筛选过程中，先后采用三项指标，即高茶皂素浓度耐受性、 高蛋白酶活性以及高纤维素酶活性，所得菌株具有既可降解粗蛋白，又可降解粗纤维，还将茶籽饼粕脱毒为低毒或无毒，功能全面；
⑵以我国现有工艺生产的未脱毒茶籽饼粕为原料，采用本发明方法获得菌株发酵茶籽饼粕，其价值高于未经发酵的茶籽饼粕，产品粗蛋白蛋白质含量为89Γ12%，游离氨基酸含量达到7. 5%以上，粗纤维含量为2(Γ25%，还原糖含量达6. 0%以上，皂素含量低于0. 5%，脱毒率高于95%。此方法可以很好地解决现有技术存在的茶籽饼粕毒性、粗蛋白粗和纤维含量高的问题。⑶本发明是农产品下脚料废弃物深度利用，具有生产工艺简单、无三废、投资小、 易于规模化生产等特点。利用该方法获得菌株可以简化多菌株、多菌种发酵茶籽饼粕生产工艺方法，减少了微生物发酵茶籽饼粕使用菌株种类，是一种能获得简化工艺、降解效果好的微生物菌株的方法。

以下实施例对本发明作进一步说明。实施例1 筛选高浓度茶皂素耐受菌株，配制高浓度茶籽饼粕固体培养基，其中茶籽饼粕10%，琼脂2.0%，水88. 0%，定容体积100 mL, pH自然，121°C灭菌25 min，倒平板8个， 每个平板按10倍稀释法涂布供试土样稀释液0. 1 mL，在35°C培养4d，获得菌落较大、涨势好、茶皂素耐受菌株 7 株，编号为 lys2201, lys2202, lys2203, lys2204, lys2205, lys2206, lys2207，并转接斜面。实施例2 :筛选高蛋白酶活性菌株，配制干酪素固体培养基，其中干酪素2. 0%，0. 1 mol/L稀盐酸加热溶解后，葡萄糖3. 0%，琼脂2. 0%，用0. 1 mol/L氢氧化钠调pH至5. 5，用自来水定容至100 mL，12rC灭菌25 min，倒平板8个。将菌株Iys2201、lys2202、lys2203、 lys2204、lys2205、lys2206, lys2207点接种于干酪素培养基上平板，在33°C培养2. 5 d， 将水解圈直径与菌落直径比值较大、涨势好的菌株再次转接无菌斜面，其中菌株lys2201、 lys2203、lys2204、lys2205、lys2207的水解圈直径与菌落直径比值均大于5. 0，并转接斜面，作进一步复筛备用。
实施例3 筛选高纤维素酶活性菌株，配制羧甲基纤维素固体培养基，其中羧甲基纤维素2. 0%，自来水加热溶解后，蛋白胨0. 5%，琼脂2. 0%，自然pH，用自来水定容至100 mL, 121°C灭菌 25 min，倒平板 8 个。将菌株 lys2201、lys2202、lys2203、lys2204、lys2205、 lys2206, lys2207点接种于羧甲基纤维素培养基上平板，在33°C培养3 d，用0. 无菌刚果红液体5 mL，染色平板水5 min，再用2.0%无菌氯化钠溶液脱色5 min，选择水解圈直径与菌落直径比值较大、涨势好的菌株再次转接无菌斜面，其中菌株lys2201、lys2202、 lys2203、lys2207的水解圈直径与菌落直径比值均大于4. 0，并转接斜面，4°C冰箱保存、备用。实施例4 茶籽饼粕摇瓶发酵复筛，配制培养基按重量百分比取茶籽饼粕4%，含水重量为94%，pH自然，100 mL 7瓶，置于250mL三角瓶，121°C灭菌25 min，分别接种菌株 lys2201、lys2202、lys2203、lys2204、lys2205、lys2206, lys2207, 200 r/min 条件下，摇床振荡培养84 h，其中菌株lys2207发酵液茶皂素含量为0. 2%、游离氨基酸含量7. 6%、还原糖含量5. 3%、蛋白酶活力与纤维素酶活力最高，因此，选择菌株lys2207作为茶籽饼粕发酵的生产菌种，4°C冰箱保存、备用。实施例5 茶籽饼粕发酵生产菌种的制备，按重量百分比取茶籽饼粕4%、麸皮2%， 含水重量为92% 97%，pH自然，121°C灭菌30 min，接种菌株lys2207，在200 r/min条件下， 15L振荡培养36 h，该种子培养液中菌体浓度达到1. 2 X IO9 cfu/mL,体积8L，作为茶籽饼粕发酵的生产菌种。实施例6 茶籽饼粕固体发酵降解，按重量百分比取茶籽饼粕40%、含水重量为 60%, 125°C灭菌30 min制成茶籽饼粕固体发酵培养基；将菌株lys2207的生产菌种，以1. 5% 的接种重量接种到该茶籽饼粕固体发酵培养基中(12000kg)，混合均勻，堆积成高0.6 mX 宽2. 5mX长10. Om的垄堆，上面覆盖草帘，45°C 55°C下发酵9天，干燥后即得脱毒且降解了的固体茶籽饼粕；产品粗蛋白含量为9%，游离氨基酸含量达到7. 7%，提高了 43. 5%，粗纤维含量为21% ；还原糖含量达6. 5%，提高了 16. 4% ；皂素含量0. 3%，降低了 96. 8%。实施例7 茶籽饼粕液体发酵降解，按重量百分比取茶籽饼粕10%、含水90%，于 100L发酵罐中，121°C灭菌30 min制成茶籽饼粕液体发酵培养基；将菌株lys2207的生产菌种，以1%的的接种重量接种到装有该茶籽饼粕液体发酵罐中，37°C下通风发酵5天，浓缩后即得脱毒且降解了的茶籽饼粕水解液。产品粗蛋白含量为8. 5%，游离氨基酸含量达到 7. 5%，提高了 40. 3%，粗纤维含量为20%，还原糖含量达6. 1%，提高了 15. 1% ；皂素含量0. 2%。


一种筛选高效降解茶籽饼粕的微生物菌株的方法，该方法依次是通过高浓度茶籽饼粕培养基初筛，干酪素培养基复筛，羧甲基纤维素培养基三次筛选，经摇瓶发酵复筛获得。该菌株同时具有茶籽饼粕高浓度茶皂素的耐受性、高蛋白酶活性和高纤维素酶活性的性能。利用该方法获得菌株发酵茶籽饼粕，其营养价值高于未经发酵的茶籽饼粕，产品粗蛋白蛋白质含量为8%~12%，游离氨基酸含量达到7.5%以上，提高了40%。粗纤维含量为20%~25%，还原糖含量达6.0%以上，提高了15%。皂素含量低于0.5%，脱毒率达95%以上。该方法很好地解决了现有技术存在的茶籽饼粕毒性、粗蛋白和粗纤维利用率低的问题。利用该方法获得菌株可以简化多菌株、多菌种发酵茶籽饼粕生产工艺方法，是一种能获得简化工艺、降解效果好的微生物菌株的方法。