专利名称：重组人干扰素ω在制备非典型肺炎防治药物中的应用的制作方法图1。用PCR的方法扩增人干扰素ω基因，分别酶切载体pMEX9K和PCR产物并回收酶切产物，连接构建重组载体pMEX9Kω并转化大肠杆菌。重组载体pMEX9Kω经线性化后电转化受体菌GS115，进行表达。人干扰素ω的分离纯化。将发酵上清直接过预平衡的疏水层析柱，用乙酸钠洗脱目的蛋白峰，目的蛋白峰可直接上样于阳离子交换柱，洗脱后再经过进一步的凝胶层析，目的蛋白得到了很好的分离。本发明所说的非典型肺炎是指SARS病毒引起的肺炎。本发明通过实验证明人干扰素ω对SARS病毒感染细胞具有明显的保护作用。到目前为止还没有其它通过实验证实对SARS病毒防治有效的药物的报道。SARS冠状病毒科研组，2个多月来，每天长时间近距离、高浓度接触病毒接触SARS标本，从开始就一直使用ω干扰素，至今无一例感染，这也可以作为一个佐证。人干扰素ω制备的防治非典型肺炎的药物的用药途径可以通过注射或粘膜给药，剂型可以为注射剂、喷雾剂或滴鼻剂。实施例一人干扰素ω对SARS冠状病毒攻击的保护作用一、材料方法病毒来源我所分离的SARS冠状病毒，以1∶20稀释使用。细胞VERO-E6细胞人干扰素ω通过基因工程方法制备。实验方法在CPL3级实验室进行实验。采用病毒学上常用的CPE法，在细胞培养板进行。预先在培养板上培养VERO-E6细胞，然后选取两排孔进行实验。二、实验结果见下表。 可以看到未加SARS冠状病毒和人干扰素ω组细胞生长正常，没有病变产生；加SARS冠状病毒而未加人干扰素ω组细胞病变明显；基因工程人干扰素ω剂量从10万国际单位至100万国际单位，对SARS冠状病毒攻击都有显著的保护作用，细胞无病变产生。提示人干扰素ω可用于SARS的预防。见图2实施例二 人干扰素ω的制备方法1材料1.1 质粒，菌种，病毒和细胞株大肠杆菌DH5α，毕赤酵母Pichia pastoris购自华美公司。1.2 酶，载体，引物和主要试剂限制性内切酶、T4DNA连接酶、质粒抽提和回收试剂盒和pGEMT载体均购自Promega公司。引物由上海生工公司合成。FICOLL，TRIZOL，琼脂糖购自华美公司。YNB为Difico公司产品。低分子量标准蛋白为AmershamPharmacia公司产品。糖苷酶PNGase F购自New England Biolabs公司。MEM培养基和新生牛血清购自Hyclone公司。其他所有化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。1.3 培养基1.3.1大肠杆菌培养基LB培养基1％蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母提取粉；LBAK培养基LB培养基中分别加入氨苄青霉素和卡那霉素至终浓度为100μg/mL。1.3.2酵母培养基YPD培养基1％酵母提取粉，1％蛋白胨，2％葡萄糖。BMGY培养基1％酵母提取粉，1％蛋白胨，1.34％YNB，1％甘油，100mmol/LpH6.0的磷酸盐缓冲液，4×10-5％生物素。BMMY培养基1％酵母提取粉，1％蛋白胨，1.34％YNB，1％甲醇，100mmol/L pH6.0的磷酸盐缓冲液，4×10-5％生物素。1.3.3 细胞培养基采用MEM培养基，添加3％～10％的新生牛血清。2方法2.1有关质粒DNA的提取、酶切、回收、连接和转化等均按参考文献(SambrookJ，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloninga laboratory manual[M].New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989，16-56)操作。2.2采用FICOLL试剂，从人血中分离白细胞，用TRIZOL提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增人干扰素ω基因，连接pGEMT载体，构建pGEMTω质粒。2.3用PCR的方法从携带人干扰素ω基因的质粒pGEMTω上扩增出该基因，人干扰素ω基因的DNA序列为序列表中序列1的核苷酸序列，序列表中序列2为人干扰素ω的氨基酸序列。扩增人干扰素ω基因同时添加相应的酶切位点上游加入Xho I切点，下游加入Eco RI切点。分别用Xho I和Eco RI酶切载体pMEX9K和PCR产物并回收酶切产物，连接并转化大肠杆菌。2.4重组质粒pMEX9KωDNA的酶切鉴定重组质粒pMEX9KωDNA用Xho I和Eco RI酶切鉴定，然后经Sal I酶切，分离纯化。2.5经过酶切的重组质粒pMEX9Kω回收，用电转化法转化毕赤酵母GS115。2.6重组克隆的筛选转化后的GS115经MD平板筛选得到his+重组克隆，将每个克隆同时点种于MD、MM平板，30℃培养2～3d，确定每一个菌株的Mut表型。2.7重组人干扰素ω的诱导表达将筛选出的重组克隆接种于5ml BMGY中，30℃300r/min培养至OD600为2.0～6.0；室温6,000r/min离心4min。收集的菌体用BMMY悬浮并稀释至OD600为1.0后，30℃300r/min诱导。每12h补加甲醇至0.5％。诱导48h后收集培养上清，SDS-PAGE检测蛋白表达并测定其生物活性。2.8重组人干扰素ω的分离纯化将诱导后48h的菌液，10,000r/min离心10min后，取上清用0.45μm滤膜过滤，上样于预平衡的大颗粒阳离子交换层析柱，洗脱目的蛋白后；目的蛋白峰上样于疏水层析柱，洗脱后上样于小颗粒阳离子交换层析柱，500mol/L氯化钠洗脱目的蛋白峰；上样于Superdex75凝胶过滤柱，并用20mmol/L PBS，150mol/L氯化钠，pH7.2洗脱目的蛋白峰。3结果将经过电转化法转化的毕赤酵母GS115进行筛选，筛选到三个表达量较高的转化子，分别进行发酵培养和诱导，离心并收集上清。活性测定结果表明，三个阳性克隆上清活性分别为3.2×106，1.6×106和3.0×106U/mL；利用SDS-PAGE检测蛋白表达，并和低分子量蛋白标准相比较，结果在22,000处的蛋白条带为目的蛋白，该蛋白分子量大于理论分子量，推测可能为糖基化所致(在目的蛋白的氨基酸序列中，有一个潜在的糖基化位点Asn80-Met81-Thr82)。利用糖苷酶PNGase F对目的蛋白的消化证实了该推测的正确(图1)。经过PNGase F消化后的目的蛋白经MALDI-TOF测定其相对分子质量与理论值基本一致(MALDI-TOF测定目的蛋白在PNGase F消化前后的分子量分别是22,166.10和20,340.71)。
目的蛋白得到了很好的分离，经薄层扫描发现，目的蛋白纯度大于95％，如图1。
序列表<110>军事医学科学院微生物流行病研究所<120>重组人干扰素ω在制备非典型肺炎防治药物中的应用<130><160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>525<212>DNA<213><400>1ctgggctgtg atctgcctca gaaccatggc ctacttagca ggaacacctt ggtgcttctg 60caccaaatga ggagaatctc ccctttcttg tgtctcaagg acagaagaga cttcaggttc120ccccaggaga tggtaaaagg gagccagttg cagaaggccc atgtcatgtc tgtcctccat180gagatgctgc agcagatctt cagcctcttc cacacagagc gctcctctgc tgcctggaac240atgaccctcc tagaccaact ccacactgga cttcatcagc aactgcaaca cctggagacc300tgcttgctgc aggtagtggg agaaggagaa tctgctgggg caattagcag ccctgcactg360accttgagga ggtacttcca gggaatccgt gtctacctga aagagaagaa atacagcgac420tgtgcctggg aagttgtcag aatggaaatc atgaaatcct tgttcttatc aacaaacatg480caagaaagac tgagaagtaa agatagagac ctgggctcat cttga525<210>2<211>174<212>PRT<213><400>2Leu Gly Cys Asp Leu Pro Gln Asn His Gly Leu Leu Ser Arg Asn Thr1 5 10 15Leu Val Leu Leu His Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Leu Cys Leu20 25 30Lys Asp Arg Arg Asp Phe Arg Phe Pro Gln Glu Met Val Lys Gly Ser35 40 45Gln Leu Gln Lys Ala His Val Met Ser Val Leu His Glu Met Leu Gln50 55 60Gln Ile Phe Ser Leu Phe His Thr Glu Arg Ser Ser Ala Ala Trp Asn65 70 75 80Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly Leu His Gln Gln Leu Gln85 90 95His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly Glu Gly Glu Ser Ala100 105 110Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg Arg Tyr Phe Gln Gly115 120 125Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu130 135 140Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe Leu Ser Thr Asn Met145 150 155 160Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu Gly Ser Ser165 170


本发明公开了重组人干扰素ω在制备防治非典型肺炎药物中的用途。人干扰素ω具有较强的抗病毒能力，对SARS病毒感染细胞具有明显保护作用。用人干扰素制备ω的药物具有广阔的市场前景和良好的社会效益。