专利名称：聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂及其制备方法人体的许多生理功能和生理、生化指标，如血压、胃酸分泌、某些激素的分泌等，呈 生物节律变化，许多疾病的发作、症状的加重与缓解等也都有其自身的规律性，如支气管哮 喘、心肌梗塞、心绞痛、风湿性疾病、胃溃疡、糖尿病、注意力缺陷综合症、血胆固醇过多、高 血压等。传统的缓、控释制剂在较长时间内维持了血药浓度，延长了药物的疗效，比起普通 制剂对临床治疗有更积极的作用。但是缓、控释制剂也逐渐暴露出它的弊端，在治疗期间， 受体长期与药物相互作用而脱敏，耐药性增加，治疗作用降低，并且药物毒副作用大，首过 效应导致生物利用率低。脉冲释药系统很好的解决了这些问题，它根据人体生物节律的变 化特点，按照生理和治疗的需要定时、定量的释放药物。它与按零级释药的控释制剂不同， 其目的不是维持稳定的血药浓度，而是按照时辰药理学的原理适时地释放药物，给药后有 一个没有药物释放的“时滞”期，按预定时间和治疗剂量单次或多次释放药物。现阶段的脉 冲释放按照触发释放的机制主要分为两种形式外界因素触发式和程序设定式两种释药系 统。其中，前者又可以分为两类，一类是利用生物化学机制触发，例如血糖水平控制胰岛素 的释放；炎症部位高浓度的羟基和透明质酸酶使得抗炎药物释放等等。另一类是利用物理 化学机制触发，包括磁场、电场、辐照、超声、温度变化等等。后者是不需要外界因素触发的 脉冲传递系统，药物的释放只取决于制剂内部结构和材料的性能，根据目标释放模式有目 的的选择材料，合理设计给药载体结构，使药物释放按照预设的步骤，自动的、有序的进行。 从病人的依从性角度考虑，程序设定式的释药方式具有明显的优势。程序设定式释药体系按照其设计机理又可分为以下几种类型体系降解形成的脉 冲释药(水凝胶自发降解型；酶降解型)；膨胀压形成的脉冲释药(渗透泵脉冲释药系统、 包衣脉冲系统和定时脉冲塞胶囊等)；体系降解和膨胀压共同形成的脉冲释药。具体分析 各类型脉冲释药体系的优势和不足(1)体系降解形成的脉冲释药体系其原理是利用高分子材料的体积溶蚀或表面 溶蚀，通过改变高分子材料的组成和性质可以调节脉冲释药的“时滞”长短。其缺点在于时 滞后释放时间过长，传统水凝胶溶胀速度较慢，吸收水的时间需要几小时甚至几天。虽然慢 的溶胀对于许多应用是有利的，但在脉冲释药体系中需要高分子网络在设定程序的时滞后 能很快地溶胀。(2)膨胀压形成的脉冲释药体系包衣型和溶蚀塞型脉冲制剂的体内时滞主要受 到与消化液接触时间的影响。(3)体系降解和膨胀压共同形成的脉冲释药体系结合了体系降解形成的脉冲释 药和膨胀压形成的脉冲释药两种脉冲体系的优势，既能够通过高分子自发降解可控性好的 特点来改善脉冲“时滞”的精确控制，又能够通过膨胀压体系脉冲释放发生后释放响应快的特点来解决脉冲释放时间的问题。体系降解和膨胀压共同形成的脉冲释药体系的典型释放模式，是由可降解的壳聚 糖衍生物微凝胶作为“核”，脂质或高分子作为“包衣”，水可以自由通过该包衣层，而微凝胶 的降解产物(降解的高分子片断)不能通过，随着微凝胶中高分子的不断降解，体系内部膨 胀压不断增加，到达临界状态，“包衣”层被胀破，形成脉冲释药，国外近年来已出现“体系降 解和膨胀压共同形成的脉冲释药体系”的研究，但主要是以脂质包衣为主。
本发明要解决的技术问题是提供一种聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制 剂及其制备方法，该脉冲制剂以聚电解质为包衣层，是一种体系降解和膨胀压共同作用的 脉冲制剂，不需要外界触发释放，在给药后，经过一个药物不释放的时滞期后，药物大量释 放。为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现本发明聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂是由自膨胀微凝胶核和聚电 解质包衣层组成，其中，自膨胀微凝胶核主要由壳聚糖和海藻酸钠组成，聚电解质包衣层是 由4-苯乙烯磺酸钠层和聚烯丙基胺盐酸盐层交替组成。聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶的粒径大小也会影响药物的释放时滞，如果粒 径过大，粒子表面张力过小，释放时滞太短；粒径过小，粒子表面张力过大，在壳聚糖海藻酸 钠结构降解坍塌之前，聚电解质包衣层不能胀破，无法形成脉冲释放，所以本发明的聚电解 质包衣微凝胶的粒径应在100nm-600 μ m范围内。上述脉冲制剂的自膨胀微凝胶核是由壳聚糖0. 1 0. 5g、海藻酸钠60 lOOmg、 氯化钙1 4g、药物200 800 μ g溶于l(Mml去离子水中制备而成。优选的，前述自膨胀微凝胶核是由壳聚糖0. 2g、海藻酸钠80mg、氯化钙2g、药物 400 μ g溶于l(Mml去离子水中制备而成。前述脉冲制剂中的包衣4-苯乙烯磺酸钠层是将自膨胀微凝胶核或微凝胶制剂 (指包裹了一层或多层聚电解质包衣层的微凝胶核)置于含4-苯乙烯磺酸钠0. 2 aiig/ ml、氯化钠7. 313 117mg/ml的去离子水溶液中吸附而成。优选的，4-苯乙烯磺酸钠层是将自膨胀微凝胶核或微凝胶制剂置于含4-苯乙烯 磺酸钠lmg/ml、氯化钠29. 25mg/ml的去离子水溶液中吸附。前述脉冲制剂中的包衣聚烯丙基胺盐酸盐层是将自膨胀微凝胶制剂置于含聚烯 丙基胺盐酸盐0. 2 2mg/ml、氯化钠7. 313 117mg/ml的去离子水溶液中吸附而成。优选的，聚烯丙基胺盐酸盐层是将自膨胀微凝胶制剂置于含聚烯丙基胺盐酸盐 lmg/ml、氯化钠29. 25mg/ml的去离子水溶液中吸附。前述脉冲制剂所用到的壳聚糖的相对分子量为20 700kd。优选的，壳聚糖的相对分子量为lOOkd。前述聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂的制备方法，包括如下步骤(1)配制壳聚糖-氯化钙溶液取壳聚糖分散于去离子水中，完全溶解后加入氯化 钙，调节PH至1.2，备用；(2)配制含药物的海藻酸钠溶液将海藻酸钠加入去离子水中，水浴加热溶解，将药物用去离子水溶解，按比例将海藻酸钠溶液和药物溶液混合，使之均勻互溶，备用；(3)微凝胶核心的制备将含药物的海藻酸钠溶液在高压静电场作用下滴入壳聚 糖-氯化钙溶液中，在磁力搅拌作用下固化成不溶于水的微凝胶，固化完全后，取出静电 场，继续磁力搅拌，使微凝胶充分固化，滤出微凝胶，去离子水洗涤，4°C保存备用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸钠层取4-苯乙烯磺酸钠和氯化钠溶于去离子水中，放入 微凝胶，在60 100W功率超声条件下使4-苯乙烯磺酸钠通过静电力作用均勻吸附在微凝 胶表面，滤出微凝胶，去离子水洗涤，即可；(5)包衣聚烯丙基胺盐酸盐层取聚烯丙基胺盐酸盐和氯化钠溶于去离子水中， 放入微凝胶，在60 100W功率超声条件下使聚烯丙基胺盐酸盐通过静电力作用均勻吸附 在微凝胶表面，滤出微凝胶，去离子水洗涤，即可；(6)重复步骤(4)和( ，即得聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂。上述技术方案中，微凝胶核心可降解，自身具有膨胀性，可产生足够的膨胀压；聚 电解质包衣层是有一定渗透性的半透膜，水等小分子可以通过，高分子的降解产物及药物 不能通过，同时它有一定的机械性能，但当内部膨胀压足够大时，可以胀破。与现有技术相比，本发明提供的脉冲制剂以聚电解质为包衣层，是一种体系降解和 膨胀压共同作用的脉冲制剂，不需要外界触发，释放完全依赖制剂自身结构和高分子材料的 性质，而且时滞可控性强，在给药后，经过一个药物不释放的时滞期后，药物大量释放，时滞后 期的释放速度也可以根据制剂物料配比进行调控，可以满足各种治疗的需要。经实验验证，本 发明脉冲制剂的组织刺激性小，安全性良好，该制剂所用材料价廉易得，核心粒径精确可控， 而且壳聚糖海藻酸钠微凝胶带有一定的PH敏感性，使制剂的释放行为更加灵活可控。下面结合附图和对本发明作进一步详细的说明。图1是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的粒径分布图和粒子表面电位 图；图2是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的扫描电镜图；图3是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的激光共聚焦显微镜图；图4是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的体外释放过程激光共聚焦显 微镜图；图5是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的体内释放过程激光共聚焦显 微镜图；图6是本发明的自膨胀微凝胶核心的膨胀度变化图；图7是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的体外释放曲线图；图8是本发明的聚电解质逐层组装自膨胀微凝胶的组织刺激性实验结果图；图9是本发明的聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶的粒径分布图；图10是本发明的聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶的透射电镜图。
FITC_dextran(2000kD)，美国 sigma 公司；聚烯丙基胺盐酸盐(PAH) (56kD)，美国sigma公司；聚4-苯乙烯磺酸钠(PSS) (70kD)，美国sigma公司；海藻酸钠(ALG)(化学纯)，国药集团化学试剂有限公司；壳聚糖(CHI)(食品级)，浙江金壳生物有限公司；氯化钠(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；氯化钙(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；高压静电场微胶囊成型装置，上海理工大学；Masersizer 2OOO (英国马尔文公司)Zetasizer nano ZS(英国马尔文公司) 实施例1制备聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂(1)制备壳聚糖-氯化钙溶液取相对分子量为IOOkd的壳聚糖粉末0. 2g，分散于 IOOml去离子水中，滴加浓盐酸至壳聚糖完全溶解，加入氯化钙粉末2g，用稀盐酸调节溶液 PH至1.2，备用；(2)配制含药物的海藻酸钠溶液取海藻酸钠粉末80mg，加入3ml去离子水中，在 50°C水浴中加热，使其溶解，得到海藻酸钠溶液，取400 μ g药物，溶于Iml去离子水中得到 药物溶液，将两种溶液混合后，剧烈涡旋，使之均勻互溶，得到含药物的海藻酸钠溶液；(3)微凝胶核心的制备(参考文献高压静电场制备微胶囊的研究，李保国，华泽 钊，刘占杰.[J].上海理工大学学报，2000，22 (3) :189-193.中的方法)将含药物的海藻酸 钠溶液吸入注射器中，调节高压静电场微胶囊成型装置电压为35KV，自动注射器的速度为 30mm/h。自动注射器以该速度将含药物的海藻酸钠溶液在电场力的作用下克服粘滞力和 表面张力，呈一定粒径的液滴滴入壳聚糖氯化钙混合溶液中，在磁力搅拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸钙壳聚糖微凝胶。待海藻酸钠全部成凝胶后，关闭高压电场，继续磁力搅拌 15min，使微凝胶固化充分。用筛网滤出微凝胶后，用去离子水洗涤，4°C保存备用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸钠层(参考文献Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B.G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a, Journal of Control IedRelease, 2006,116(2) : 159-169.)取 4-苯乙烯磺酸钠 IOmg 和氯 化钠四2. 5mg溶于IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使4-苯乙烯磺酸钠 通过静电力的作用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多 余的4-苯乙烯磺酸钠聚电解质，即可；(5)包衣聚烯丙基胺盐酸盐层取聚烯丙基胺盐酸盐IOmg和氯化钠四2. 5mg溶于 IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使聚烯丙基胺盐酸盐通过静电力的作 用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多余的聚烯丙基胺 盐酸盐聚电解质，即可；(6)重复步骤⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚电解质层数，即得。经过模型药物的体外释放实验表明，本发明制剂的模型药物释放时滞在2 5小 时，时滞后迅速释放量可达80 %左右，使用高压静电场成囊装置控制粒径，使粒径均勻，表 面张力大小相差不大，粒子释放时滞基本一致。
同样，以下实施例2和3所得到的聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂具 有组织刺激性小，安全性良好的优点。实施例2本实施例制备聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂如下(1)制备壳聚糖-氯化钙溶液取相对分子量为700kd的壳聚糖粉末0. Ig,分散于 IOOml去离子水中，滴加浓盐酸至壳聚糖完全溶解，加入氯化钙粉末lg，用稀盐酸调节溶液 PH至1.2，备用；(2)配制含药物的海藻酸钠溶液取海藻酸钠粉末60mg，加入3ml去离子水中，在 50°C水浴中加热，使其溶解，得到海藻酸钠溶液，取800 μ g药物，溶于Iml去离子水中得到 药物溶液，将两种溶液混合后，剧烈涡旋，使之均勻互溶，得到含药物的海藻酸钠溶液；(3)微凝胶核心的制备(参考文献高压静电场制备微胶囊的研究，李保国，华泽 钊，刘占杰.[J].上海理工大学学报，2000，22 (3) :189-193.中的方法)将含药物的海藻酸 钠溶液吸入注射器中，调节高压静电场微胶囊成型装置电压为35KV，自动注射器的速度为 30mm/h。自动注射器以该速度将含药物的海藻酸钠溶液在电场力的作用下克服粘滞力和 表面张力，呈一定粒径的液滴滴入壳聚糖氯化钙混合溶液中，在磁力搅拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸钙壳聚糖微凝胶。待海藻酸钠全部成凝胶后，关闭高压电场，继续磁力搅拌 15min，使微凝胶固化充分。用筛网滤出微凝胶后，用去离子水洗涤，4°C保存备用；使用高压 静电场成囊装置控制粒径，使粒径均勻，表面张力大小相差不大，粒子释放时滞基本一致。(4)包衣4-苯乙烯磺酸钠层(参考文献Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B. G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a, Journal of Control IedRelease, 2006,116(2) : 159-169.)取 4_ 苯乙烯磺酸钠 20mg 和氯 化钠1170mg溶于10ml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使4-苯乙烯磺酸钠 通过静电力的作用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多 余的4-苯乙烯磺酸钠聚电解质，即可；(5)包衣聚烯丙基胺盐酸盐层取聚烯丙基胺盐酸盐2mg和氯化钠73. 13mg溶于 IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使聚烯丙基胺盐酸盐通过静电力的作 用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多余的聚烯丙基胺 盐酸盐聚电解质，即可；(6)重复步骤⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚电解质层数，即得本实 施例所述聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂。实施例3本实施例制备聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂如下(1)制备壳聚糖-氯化钙溶液取相对分子量为20kd的壳聚糖粉末0. 5g，分散于 IOOrnl去离子水中，滴加浓盐酸至壳聚糖完全溶解，加入氯化钙粉末4g，用稀盐酸调节溶液 PH至1.2，备用；(2)配制含药物的海藻酸钠溶液取海藻酸钠粉末100mg，加入3ml去离子水中，在 50°C水浴中加热，使其溶解，得到海藻酸钠溶液，取200 μ g药物，溶于Iml去离子水中得到 药物溶液，将两种溶液混合后，剧烈涡旋，使之均勻互溶，得到含药物的海藻酸钠溶液；
(3)微凝胶核心的制备(参考文献高压静电场制备微胶囊的研究，李保国，华泽 钊，刘占杰.[J].上海理工大学学报，2000，22 (3) :189-193.中的方法)将含药物的海藻酸 钠溶液吸入注射器中，调节高压静电场微胶囊成型装置电压为35KV，自动注射器的速度为 30mm/h。自动注射器以该速度将含药物的海藻酸钠溶液在电场力的作用下克服粘滞力和 表面张力，呈一定粒径的液滴滴入壳聚糖氯化钙混合溶液中，在磁力搅拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸钙壳聚糖微凝胶。待海藻酸钠全部成凝胶后，关闭高压电场，继续磁力搅拌 15min，使微凝胶固化充分。用筛网滤出微凝胶后，用去离子水洗涤，4°C保存备用；使用高压 静电场成囊装置控制粒径，使粒径均勻，表面张力大小相差不大，粒子释放时滞基本一致。(4)包衣4-苯乙烯磺酸钠层(参考文献Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B. G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a, Journal of Control ledRelease，2006，116 O) :159-169.)取 4-苯乙烯磺酸钠 2mg 和氯 化钠73. 13mg溶于IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使4-苯乙烯磺酸钠 通过静电力的作用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多 余的4-苯乙烯磺酸钠聚电解质，即可；(5)包衣聚烯丙基胺盐酸盐层取聚烯丙基胺盐酸盐20mg和氯化钠1170mg溶于 IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使聚烯丙基胺盐酸盐通过静电力的作 用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多余的聚烯丙基胺 盐酸盐聚电解质，即可；(6)重复步骤⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚电解质层数，即得本实 施例所述聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂。实施例4本实施例制备聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂如下(1)制备壳聚糖-氯化钙溶液取相对分子量为20kd的壳聚糖粉末0. Ig,分散于 IOOrnl去离子水中，滴加浓盐酸至壳聚糖完全溶解，加入氯化钙粉末lg，用稀盐酸调节溶液 PH至1.2，备用；(2)配制含药物的海藻酸钠溶液取海藻酸钠粉末60mg，加入3ml去离子水中，在 50°C水浴中加热，使其溶解，得到海藻酸钠溶液，取800 μ g药物，溶于Iml去离子水中得到 药物溶液，将两种溶液混合后，剧烈涡旋，使之均勻互溶，得到含药物的海藻酸钠溶液；(3)微凝胶核心的制备(参考文献高压静电场制备微胶囊的研究，李保国，华泽 钊，刘占杰.[J].上海理工大学学报，2000，22 (3) :189-193.中的方法)将含药物的海藻酸 钠溶液吸入注射器中，调节高压静电场微胶囊成型装置电压为95KV，自动注射器的速度为 30mm/h。自动注射器以该速度将含药物的海藻酸钠溶液在电场力的作用下克服粘滞力和 表面张力，呈一定粒径的液滴滴入壳聚糖氯化钙混合溶液中，在磁力搅拌作用下固化成不 溶于水的海藻酸钙壳聚糖微凝胶。待海藻酸钠全部成凝胶后，关闭高压电场，继续磁力搅拌 15min，使微凝胶固化充分。用筛网滤出微凝胶后，用去离子水洗涤，4°C保存备用；(4)包衣4-苯乙烯磺酸钠层(参考文献Layer-by-layer coating of degradablemicrogeIs for pulsed drug delivery[J]. B. G.De Geest, C. Dejugnat, E. Verhoeven, G. B. Sukhorukov, A. M. Jonas, J. Plain, J. Demeester, S. C. De Smedt a,Journal of Control ledRelease，2006，116 O) :159-169.)取 4-苯乙烯磺酸钠 2mg 和氯 化钠73. 13mg溶于IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使4-苯乙烯磺酸钠 通过静电力的作用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多 余的4-苯乙烯磺酸钠聚电解质，即可；(5)包衣聚烯丙基胺盐酸盐层取聚烯丙基胺盐酸盐2mg和氯化钠73. 13mg溶于 IOml去离子水中，放入微凝胶，80W功率超声15min，使聚烯丙基胺盐酸盐通过静电力的作 用充分均勻吸附在微凝胶表面，用筛网滤出微凝胶，去离子水洗涤，去除多余的聚烯丙基胺 盐酸盐聚电解质，即可；(6)重复步骤⑷和(5)，交替吸附PSS和PAH至所需的聚电解质层数，即得本实 施例所述聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂。采用实施例1 4的方法制备本发明的脉冲制剂，进行如下的实验验证一、粒径及表面电位的测定将微凝胶核分散在去离子水中，用Masersizer2000*ktasizer nano M分别测 得未包衣聚电解质微凝胶的粒径和zeta电位，在聚电解质逐层吸附过程中，每吸附一层聚 电解质，同步测量一次微凝胶粒径及电位，得到自组装微凝胶在制备过程中的粒径变化及 电位变化。结果显示，实施例1 3未包衣的壳聚糖-海藻酸钠微凝胶的平均粒径是 409. 18士6.47μπι(η = 3)，如图I(A)所示，而且粒径分布范围较窄。由于聚电解质层有一 定的厚度，(PSS/PAH) 3包衣微凝胶脉冲制剂的平均粒径是452. 90士2. 71 μ m(n = 3)，如图 KB)所示。在逐层包衣过程中，粒子表面电位交替变化如图1 (C)所示。实施例4中在制备时上调高压静电场压力，可以得到粒径较小的粒子，用 ktasizernanc^S测得平均粒径为152. 9士3. 51nm，如图9所示。取一定量包衣微凝胶置于 铜网上，用吹风机吹干表面水分后，在透射电镜下观察形态，如图10所示。二、扫描电镜观察分别取一定量壳聚糖-海藻酸钠微凝胶核心和聚电解质包衣微凝胶，用滤纸擦干 表面多余水分之后，放在样品板上，在扫描电镜的低真空模式下观察，得到未包衣微凝胶 (如图2㈧所示)和聚电解质包衣微凝胶(如图2(B)所示)的完整形态。分别取一定量空白微凝胶和空白聚电解质包衣微凝胶，用梯度乙醇-水溶液(乙 醇/水30% 100% )逐一浸泡10min，4°C自然挥干乙醇，将样品涂于样品板上，喷金粉后， 在扫描电镜的高真空模式下观察，得到未包衣微凝胶(如图2(C)所示)和包衣微凝胶(如 图2 (D)所示)的表面形态。未包衣微凝胶和包衣微凝胶的形态较圆整，由于微凝胶内部是液态结构，所以在 真空状态下，微凝胶表面会因为少量失水而皱缩。但是聚电解质包衣层有一定的机械强度， 相比未包衣微凝胶，更好的保持了球体的圆整性。并且包衣前后，微凝胶的表面形态也发生 了变化。三、激光共聚焦显微镜观察取少量载FITC-dextranQOOOkD)的微凝胶，用 PSS 和 PAH-RBITC 包衣至(PSS/ PAh-RBITO2，滴加到直径3. 5cm的塑料培养皿上，置于共聚焦显微镜下观察，药物在微凝胶中的分布比较均勻，聚电解质均勻吸附在微凝胶核心的表面，并没有侵染到核心内部，如图 3所示。四、释体外放全过程取少量载FITC-dextranQOOOkD)的微凝胶，用 PSS 和 PAH-RBITC 包衣至(PSS/ PAH-RBITC)2，用滤纸擦干表面水分后，置于直径3. 5cm的塑料培养皿中，滴入少量PBS溶液 (用NaOH调至pHll)，固定于37°C恒温槽中，在激光共聚焦显微镜下观察变化，并且拍摄变 化的全过程。如图4所示(Al A6)，激光共聚焦显微镜视野下，聚电解质包衣微凝胶逐渐膨胀， 粒径增大(Al Α； )(选择任意两个包衣微凝胶粒子，粒径变化由477 μ m增大到515 μ m，另 一个由352 μ m到404 μ m)，胀破包衣层(A4)，药物大量释放出来脚，最后微凝胶失去圆整 形态，结构坍塌(A6)。符合体系降解和膨胀压共同形成的脉冲释药系统的理论释放机制。五、体内释放全过程将(PSS/PAH)4包衣的壳聚糖海藻酸钠微凝胶在紫外灯下辐照15min后，均勻分散 于灭菌的细胞用PBS中。用脱毛膏将小鼠的侧腹部脱毛后，分别取0. 2ml包衣微凝胶注射 于小鼠两侧腹部皮下。在lh、3h、4h后，各处死一只小鼠，立即取下包围在微凝胶周围的皮 下组织，做冷冻切片，切成8 μ m的薄片后，在激光共聚焦显微镜下观察聚电解质包衣微凝 胶变化过程。他后处死一只小鼠，取下包围在微凝胶周围的皮下新鲜组织，放于4 %多聚甲 醛中4°C条件下保存Μι。组织以梯度浓度的乙醇溶液脱水后，切成4μπι薄片，DAPI染色， 加一滴抗荧光淬灭剂，石蜡包埋后，在激光共聚焦显微镜下观察药物的释放情况，如图5所
7J ο图5中可见，聚电解质逐层组装的微凝胶经小鼠皮下注射后，初期(Ih)基本保持 圆整形态；3h后包衣微凝胶开始变形，但是聚电解质膜结构仍然保持完整，药物仍然储存 在制剂内部；4h时，包衣微凝胶已经开始破裂，并有少量药物释放，所以推测体内时滞应该 在池至4h之间出h后，药物几乎全部释放，聚电解质层破裂，包衣微凝胶结构彻底坍塌，药 物释放到皮下组织中。六、壳聚糖-海藻酸钠微凝胶核心的膨胀性能测定将制备好的新鲜未包衣微凝胶分散于去离子水中，取出一部分，立即用激光粒度 仪测其粒径，得到未包衣微凝胶的原始粒径Ltl;用筛网(106μπι)将剩余微凝胶收集起来， 滤去水分，在50ml离心管中，用PBS (ρΗ 7.4)溶液重新分散，置于37°C水浴摇床中，分别于 lh、2h、;3h将其取出部分测其粒径Ln，计算得(LnZltl) X 100%，得到粒径变化的百分比，各处 方平行三份，以时间为横坐标，粒径变化的百分比为纵坐标作图，如图6所示。七、本脉冲制剂的体外释放实验将新鲜包衣微凝胶用滤纸吸干水分后，精密称取一定量(每个处方称取的包衣微 凝胶质量尽可能的接近，避免包衣微凝胶膨胀后的体积影响释放液的体积，导致累积释放 量计算不准确)，置于50ml离心管中，用移液管取7ml PBS (ρΗ 7. 4)，将离心管放于37°C水 浴摇床中，在设定时间点将离心管取出，待大部分微凝胶沉降后，取上清液0. 7ml，同时补足 新鲜PBS释放液0. 7ml。将样品在15000rpm速度下离心5min，取上清液0. 6ml，用荧光分光 光度计检测吸光度A，计算累积释放量，各处方平行三份，以时间为横坐标，累积释放量为纵 坐标作图，如图7所示。
本发明制剂(PSS/PAH)4包衣微凝胶的释放时滞为2. 35h左右，时滞后0. 95h释放 量达到80% ； (PSS/PAH)6包衣微凝胶的释放时滞为4. 15h左右，时滞后1. 52h释放量达到 80%。八、组织刺激性试验将制备的新鲜载FITC-dextran包衣微凝胶在紫外灯下辐照15min后，均勻分散于 灭菌的细胞用PBS中。用脱毛膏将小鼠的侧腹部脱毛后，取0. 2ml包衣微凝胶注射于小鼠 侧腹部皮下，在他后处死一只小鼠，立即取下包围在微凝胶周围的皮下组织，放于4%多聚 甲醛固定液中4°C条件下保存24h后，组织依次以梯度浓度的乙醇溶液脱水，然后切成4 μ m 薄片，苏木精-伊红(HE)染色，石蜡包埋后于光学显微镜下观察。同时，取另一只小鼠注射 生理盐水作为对照组，结果如图8所示。A2是已经破裂的包衣微凝胶，此时药物已经释放。注射制剂部位的皮下细胞(Al) 与注射生理盐水的皮下细胞(B》相比，未出现任何异常，给药部位周围组织未出现组织损 伤和坏死，也没有炎症反应以及血管增生，说明制剂安全，生物相容性好。以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。


本发明公开了一种聚电解质逐层组装的自膨胀微凝胶脉冲制剂及其制备方法，所述制剂是由自膨胀微凝胶核和聚电解质包衣层组成，粒径为100nm～600μm，其中，自膨胀微凝胶核主要由壳聚糖和海藻酸钠组成，聚电解质包衣层是由4-苯乙烯磺酸钠层和聚烯丙基胺盐酸盐层交替组成，是一种体系降解和膨胀压共同作用的脉冲制剂，释放完全依赖制剂自身结构和高分子材料的性质，而且时滞可控性强，在给药后，经过一个药物不释放的时滞期后，药物大量释放，经实验验证，本发明脉冲制剂的组织刺激性小，安全性良好，该制剂所用材料价廉易得，核心粒径精确可控，而且壳聚糖海藻酸钠微凝胶带有一定的pH敏感性，使制剂的释放行为更加灵活可控。