专利名称:脐带间充质干细胞数字化自动生产系统的制作方法传统的细胞培养,大都是人工操作,对生产的各个方面有诸多的限制,比如人员素质、洁净工作室级别、操作管理规章制度等。尽管具备了严格化的生产管理及完善的质量控制,诸多人为因素对干细胞生产的影响也是不可避免的,细胞的质量及稳定性仍然不能保证。目前,生物反应器在国内外诸如疫苗生产的细胞规模生产领域已经广泛开展起来,它可以有效地提高细胞及相关产物的生产效率并减小细胞生产的风险。然而,生物反应器尚未成熟的应用到间充质干细胞,主要原因是1.此项技术条件较高,需要选用合适的载体以使细胞贴附并在立体失重的环境下培养;2.立体失重的细胞培养环境同传统的静止培养有诸多的不同,因此生产出的细胞质量尚不可知,这对间充质干细胞的临床应用也存在一定的风险;3.实践中为了保证间充质干细胞临床应用的疗效和安全性,并不允许长时间扩增,也无需太多的细胞,这也限制了传统的大规模生产细胞的生物反应器的应用。
图1为本实用新型结构示意图。图1中生物反应器1,控制系统11,加液装置12,去液装置13,供气装置14,探测装置15 ;机械流水线2,电子控制装置21,电机22,动作臂23,工作架M、25J6 ;第一培养瓶3、第二培养瓶4,第三培养瓶5。以下结合附图对本实用新型作进一步详细说明。图1所示中的一种脐带间充质干细胞数字化自动生产系统,包括培养瓶、机械流水线2、生物反应器1。所述的机械流水线2包括电子控制装置21以及分别与电子控制装置连接的至少三组机械传动装置,所述各机械传动装置分别包括工作架M、驱动工作架运动的动作臂23以及驱动动作臂工作的电机22,电机连接电子控制装置,电子控制装置与生物反应器的控制系统11连接,每只工作架上放置一培养瓶,每个工作架上还设有与电子控制装置连接的加热装置,实现细胞培养过程对培养瓶的加热需要。本实用新型所述的生物反应器1包括控制系统11、探测装置15、供气装置14、加液装置12、去液装置13和数字显示触摸屏,所述探测装置15、供气装置14、加液装置12、去液装置13、数字显示触摸屏均与控制系统11连接,所述探测装置15包括二氧化碳探头、温度探头、PH探头等若干根探头,探测装置的每根探头和供气装置的供气管均设置于每只培养瓶的瓶盖上,每根探头均由各培养瓶的瓶口伸入细胞培养瓶中探测细胞培养过程中所需参数,并将探测信号发送给控制系统;供气装置14为细胞生长提供所需的气体并保持各培养瓶间气压恒定,供气装置的供气量、加液装置12的加液量以及去液装置13的去液量均由控制系统11控制。生物反应器1将探测装置各探头的探测信号分析处理后发出补气、加液、去液、收集信息,并将数据信息传输给机械流水线2的电子控制装置21,电子控制装置控制动作臂23运动使工作架上的培养瓶完成细胞培养过程的振荡、倾斜、翻转90度等机械动作; 加液装置12中设有医用生理盐水、无需中和的消化酶、临床级细胞培养液。所述培养瓶包括至少三只培养瓶3、4、5,至少三只培养瓶的瓶盖和瓶底同在一水平面上放置于机械流水线2的工作架M、25J6上,至少三只培养瓶的瓶盖上均设置生物反应器的供气装置14、探测装置15 ;至少三只培养瓶的第一培养瓶3为原代细胞的单层培养瓶,第二、三培养瓶4、5为内设有多层细胞培养平面的传代培养瓶;第一培养瓶3的瓶底设有四个接口分别为加液接口 Al、组织块添加接口 A2、去液接口 A3和收集接口 A4 ;第二培养瓶4的瓶底设有四个接口分别为加液接口 Bi、细胞添加接口 B2、去液接口 B3和收集接口 B4 ;第三培养瓶5的瓶底部设有四个接口分别为加液接口 Cl、细胞添加接口 C2、去液接口 C3和收集接口 C4 ;第一培养瓶3的加液接口 Al、第二培养瓶4的加液接口 Bi、第三培养瓶 5的加液接口 Cl均连接生物反应器1的加液装置12,作用是从生物反应器的加液装置中经加液接口补加培养液、消化液等细胞培养所需的相关溶液,且加液接口 A1、B1、C1上均设有 0. 22 μ m过滤器,防止加液污染;第一培养瓶3的去液接口 A3、第二培养瓶4的去液接口 B3、 第三培养瓶5的去液接口 C3均连接生物反应器1的去液装置13,作用是将已培养细胞的培养液、消化液等溶液从去液接口移向生物反应器的去液装置,且第一培养瓶3的去液接口 A3上设有孔径大小为2mm的筛网,防止第一培养瓶去液时组织块移出;第一培养瓶3的组织块添加接口 A2是直径Icm的圆型接口,其作用是添加脐带华通氏胶组织块,添加后即封闭,第一培养瓶3的收集接口 A4是将收集的原代细胞送至第二培养瓶4的细胞添加接口 B2,第二培养瓶4的收集接口 B4将收集的传代细胞送至第三培养瓶5的细胞添加接口 C2, 通过第三培养瓶5的收集接口 C4将最终培养出的细胞收集至细胞收集容器中,第三培养瓶 5收集接口 C4在细胞培养过程中封闭,且收集接口 A4、B4、C4上均设有200目筛网,防止未消化成单细胞的细胞团移出。第二培养瓶4和第三培养瓶5间可增设一个或多个与第二培养瓶结构相同的传代细胞培养瓶。进一步地,所述第一、二、三培养瓶3、4、5瓶底的若干个接口均设置于培养瓶瓶底的上部或顶部位置,且若干个接口均处于同一水平面上。当培养瓶水平翻转倒置时,若干个接口均处于下方,方便液体顺利地由相应接口流出,当培养瓶受控翻转呈90度竖直状态时,收集接口均位于培养瓶最下方,液体或细胞等能从培养瓶顺畅流出,方便快速执行细胞传代换液的相关操作。所述第二、三培养瓶4、5内或第二与第三培养瓶间增设的培养瓶内均设有多层细胞培养平面,每层培养平面的两侧均和细胞培养瓶两侧相接,每层培养平面另外两侧与细胞培养瓶的瓶底和瓶盖分离且设有高出培养平面4mm的边界,可与培养瓶两侧围合成水池状,水平盛装4mm高度以下的液体,多层细胞培养平面相互之间为平行不接触设置。加液时,为保证第二、第三培养瓶各细胞培养层液体分布均勻,均由机械流水线2控制培养瓶侧翻90度后迅速正置,当培养瓶侧翻90度状态时,液体汇集于瓶侧下部以及瓶底和瓶盖处, 当培养瓶瞬间翻转正置时,培养瓶内液体能立即均勻分布至各层培养平面,充分利用了培养瓶的有效空间;去液时,培养瓶侧翻90度后停留5秒钟,液体汇集于瓶侧下部以及瓶底和瓶盖处,缓慢倒置,液体即完全汇集到培养瓶最下方,液体或细胞等能从培养瓶顺畅流出, 方便快速执行细胞传代换液的相关操作。本实用新型应用于细胞培养的步骤如下(1)将无菌采集的脐带剪成Imm3的组织块,组织块经培养液重悬后经第一培养瓶的组织块添加接口 A2加入,然后关闭组织块添加接口 A2,系统进入细胞培养状态,生物反应器的探测装置对培养过程的各项参数进行探测;(2)生物反应器控制供气装置使细胞生长过程中(X)2的浓度始终保持在5%,并保持培养瓶气压恒定;当培养液中营养物质消耗过多,生物反应器和机械流水线协同操作换液如下第一培养瓶即原代组织块培养瓶受控振荡10秒钟后翻转倒置,培养液由去液接口 A3排除,第一培养瓶受控翻转正置,经加液接口 Al补充新的培养液;(3)机械流水线保持第一培养瓶中细胞培养温度37°C恒定,并定期微小振荡,保证原代细胞贴壁均一;(4)生物反应器的探测装置通过探测各项关键参数变化趋势,分析、判断出第一培养瓶中的细胞生长状况,并计算出细胞传代的时间,细胞消化所需的各种液体的量;(5)至细胞传代时,第一培养瓶受控翻转倒置,培养液由去液接口 A3排除,第一培养瓶受控翻转正置,经加液接口 Al补充生理盐水,机械流水线振荡使第一培养瓶洗涤10秒钟,第一培养瓶受控翻转倒置,生理盐水由去液接口 A3排除,第一培养瓶受控翻转正置,再经加液接口 Al补充细胞消化所需的酶,机械流水线振荡培养瓶37°C消化5分钟,第一培养瓶受控翻转呈90度竖直,使细胞悬液经收集接口 A4转移至第二培养瓶的细胞添加接口 B2, 第一培养瓶受控翻转正置,再经加液接口 Al补充少量培养液,机械流水线振荡培养瓶10秒钟,第一培养瓶受控翻转呈90度竖直,使残留细胞悬液经收集接口 A4转移至第二培养瓶的细胞添加接口 B2 ;(6)第一培养瓶受控复位,经加液接口 Al补充培养液,瓶中原代组织块继续培养;(7)第二培养瓶受控侧翻90度后迅速正置以保证各细胞培养层液体分布均勻,静置培养12小时使细胞贴壁,第二培养瓶受控侧翻90度后停留5秒钟后缓慢倒置,培养液经去液接口 B3排除,第二培养瓶受控翻转正置,生理盐水经加液接口 Bl加入,第二培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡洗涤10秒钟,第二培养瓶受控侧翻90度后停留 5秒钟后缓慢倒置,生理盐水由去液接口 B3排除,第二培养瓶受控翻转正置,经加液接口 Bl 补加新的培养液,第二培养瓶受控侧翻90度后迅速正置后静置培养;探测装置通过探测各项关键参数变化趋势,分析、判断出第二培养瓶中细胞生长状况,并计算出细胞传代的时间和细胞消化所需的各种液体的量;(8)至细胞传代时,第二培养瓶受控侧翻90度后停留5秒钟后缓慢倒置,培养液由去液接口 B3排除,培养瓶受控翻转正置,经加液接口 Bl补充生理盐水,第二培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡培养瓶洗涤10秒钟,培养瓶受控侧翻90度后停留5 秒钟后缓慢倒置,生理盐水由去液接口 B3排除,培养瓶受控翻转正置,再经加液接口 Bl补充细胞消化所需的酶,第二培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡培养瓶37°C 消化5分钟,培养瓶受控翻转呈90度竖直状态,使细胞悬液经收集接口 B4转移至第三培养瓶的细胞添加接口 C2,第二培养瓶受控翻转正置,再经加液接口 Bl补充少量培养液,第二培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡培养瓶10秒钟,第二培养瓶受控翻转呈90度竖直状态,使残留细胞悬液经收集接口 B4转移至第三培养瓶的细胞添加接口 C2 ;(9)第二培养瓶受控复位,等待从第一培养瓶中消化的细胞再次移入培养;(10)第三培养瓶受控侧翻90度后迅速正置以保证各细胞培养层液体分布均勻, 静置培养12小时使细胞贴壁,第三培养瓶受控侧翻90度后停留5秒钟后缓慢倒置,培养液经去液接口 C3排除,第三培养瓶受控翻转正置,生理盐水经加液接口 Cl加入,第三培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡洗涤10秒钟,第三培养瓶受控侧翻90度后停留5秒钟后缓慢倒置,生理盐水由去液接口 C3排除,第三培养瓶受控翻转正置,经加液接口 Cl补加新的培养液,第三培养瓶受控侧翻90度后迅速正置后静置培养;探测装置通过探测各项关键参数变化趋势,分析、判断出第三培养瓶中细胞生长状况,并计算出细胞传代的时间和细胞消化所需的各种液体的量;(11)细胞传代时,第三培养瓶受控侧翻90度后停留5秒钟后缓慢倒置,培养液由去液接口 C3排除,培养瓶受控翻转正置,经加液接口 Cl补充生理盐水,第三培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡培养瓶洗涤10秒钟,培养瓶受控侧翻90度后停留5 秒钟后缓慢倒置,生理盐水由去液接口 C3排除,培养瓶受控翻转正置,再经加液接口 Cl补充细胞消化所需的酶,第三培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡培养瓶37°C 消化5分钟,培养瓶受控翻转呈90度竖直状态,使细胞悬液经收集接口 C4转移至细胞收集容器中,第三培养瓶受控翻转正置,再经加液接口 Cl补充少量培养液,第三培养瓶受控侧翻90度后迅速正置,机械流水线振荡培养瓶10秒钟,第三培养瓶受控侧翻90度后停留 5秒钟后缓慢倒置,使残留细胞悬液经收集接口 C4转移至细胞收集容器中;(12)从第一培养瓶中长出的细胞,重复上述步骤0)-(11)操作3次后,此来源的脐带间充质干细胞培养的操作结束;(13)细胞收集容器中收集的细胞经简单的洗涤即可得到临床用的脐带间充质干细胞。
脐带间充质干细胞数字化自动生产系统制作方法
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