专利名称：一种斜带石斑鱼抗菌肽的原核表达产物及其制备方法抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是鱼类先天免疫系统的重要组成成分， 鱼类可分泌产生多种抗菌肽来抵抗水生环境中大量的病原微生物的侵袭，这些病原微生物包括多种细菌、真菌和病毒等等。利用分子生物学技术，在体外获得大量的、有活性的抗菌肽产品，进一步应用这些抗菌肽产品可能增强水产动物的免疫力，提高养殖产量，并对解决海水养殖中面临的由于长期滥用抗生素而引起的细菌耐药性、水产品药物残留和水环境污染等问题具有重要的科学、现实和经济意义。斜带石斑鱼(Epinephelus coioides，orange-spotted grouper)俗禾尔青斑，是暖水性中下层鱼类，主要分布于印度洋、红海、地中海、北太平洋西部和东南亚地区。其肉质鲜美、营养丰富、抗逆性强、生长快、体色艳丽，市场价格高且稳定，目前斜带石斑鱼已成为世界上育苗量和人工养殖产量最高的石斑鱼类，也是我国福建、广东、海南、台湾四省重要的海水养殖鱼类之一。但是近年来，由于致病性微生物引起的鱼病爆发，使得斜带石斑鱼养殖业承受着巨大的经济损失(1.林建辉.斜带石斑鱼的生物学特性及养殖技术[J].齐鲁渔业，2008，25⑵:22-23 ；2.黄瑞芳.斜带石斑鱼溶藻弧菌病的研究[J]·水产科学，2005， 24(6) 1-3 ；3.梅冰，周永灿，徐先栋，王世峰，谢珍玉.斜带石斑鱼烂尾病病原菌的分离与鉴定[J].热带海洋学报，2010，四(6) :118-124) 0本申请人在前期研究中从青石斑鱼(Epin印helus awoara)中克隆获得了 1个成熟肽具有4个半胱氨酸残基的h印cidin基因，继而从福建漳浦的养殖斜带石斑鱼中克隆得到了另1个新的成熟肽含有4个半胱氨酸残基的h印cidin基因，与已报道的另外2个在斜带石斑鱼中发现的h印cidin基因EC-h印cidinl和EC_h印cidin2具有同源性，推测是其变体，故命名为EC-h印cidin3。已发现人工合成的EC-h印cidinl和EC_h印cidin2的成熟肽具有抗菌、抗病毒白勺作用(4. Jing-Geng Zhou, Jing-Guang Wei, Dan Xu, Hua-Chun Cui, Yang Yan, Zheng-Liang Ou-Yang, Xiao-Hong Huang, You-Hua Huang, Qi-ffei Qin. Molecular cloning and characterization of two novel hepcidins from orange-spotted grouper, Epinephelus coioides[J]· Fish&Shellfish Immunology,2011,30 :559-568)。同其他已发现的鱼类h印cidin结构一样，EC-h印cidin3包括内质网靶向的位于N端的信号肽，前导肽和位于C端的成熟肽，其中前导肽和成熟肽共同构成前体肽 (propeptide of EC_hepcidin3, EC-proHep3)。
本发明的目的旨在提供一种斜带石斑鱼抗菌肽的原核表达产物及其制备方法。本发明构建的一种含有EC-h印cidin3基因的表达载体可在大肠杆菌中诱导表达，并通过高效纯化表达产物而在体外获得大量的表达产品。所述含有EC-h印cidin3基因的表达载体，是在原核表达载体pETISa+中插入EC-h印cidin3前体肽基因序列所构成的重组表达载体pEI^8a/EC-h印cidin3。本发明所述在体外获得的表达产物，是重组表达载体pET28a/EC_h印cidin3在大肠杆菌中经诱导表达以及纯化后获得的重组蛋白EC-proH印3。所述EC-h印cidin3前体肽的基因序列如序列表第1序列所示。所述EC-h印cidin3前体肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。所述重组蛋白EC-proH印3的制备方法包括以下步骤1)构建重组表达载体；2)将步骤1)所得重组表达载体导入宿主细胞，获得可表达EC-proH印3的基因工程菌菌株；3)发酵培养已得到的基因工程菌菌株并进行诱导表达，获得表达产物；4)分离纯化步骤幻所得的表达产物，获得重组蛋白EC-proH印3。在步骤1)中，所述表达载体可为ρΕΤ48ει+等。在步骤幻中，所述宿主细胞可为大肠杆菌E. coli Rosette等。在步骤幻中，所述表达产物为先通过离心收集表达菌体，将表达菌体重悬并超声破碎后再离心收集得到的上清液。在步骤4)中，所述分离纯化可采用亲和层析法纯化。本发明借助分子生物学技术，利用原核表达载体pETjSa+和原核表达菌株E. coli Rosette,成功在体外表达了可溶的、易纯化分离的、具有抗菌活性的重组蛋白EC-proH印3。重组蛋白EC-proH印3具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌如溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus Fleming)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)，对革兰氏阴性菌如施氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)都具有明显的抑制作用。重组蛋白EC-proH印3的基因工程表达产品将在斜带石斑鱼养殖业中研发抗病原微生物新药、饲料添加剂和免疫增强剂等方面具有重要的应用价值。本发明构建的一种含有EC-h印cidin3基因的表达载体可在大肠杆菌中诱导表达，并通过高效纯化表达产物而在体外获得大量的表达产物。所述含有EC-h印cidin3基因的表达载体，是在原核表达载体PETjSa+中插入EC-h印cidin3前体肽基因序列所构成的重组表达载体pEI^8a/EC-h印cidin3。本发明所述在体外获得的表达产物，是重组表达载体pET28a/EC_h印cidin3在大肠杆菌中经诱导表达以及纯化后获得的重组蛋白EC-proH印3。图1为PCR扩增斜带石斑鱼抗菌肽H印cidin3前体肽基因序列结果电泳图。在图 1中，1为PCR扩增后产物；M为DL2000DNA Marker。图2为PETjSa+载体酶切处理后的电泳图。在图2中，bp代表碱基对数目；M为 DL2000DNA Marker ；1为未进行酶切的pET48a+载体，2为使用NcoI和BioI进行双酶切后的pET48a+载体。图3为检测蛋白表达情况的SDS-PAGE电泳图。在图3中，KDa代表蛋白质的分子量(千道尔顿)；Ml为蛋白质Marker ； 1为pET28a/EC_h印cidin3重组表达载体诱导前菌体总蛋白样品；2为pET28a/EC-h印cidin3重组表达载体诱导后菌体总蛋白样品。图4为表达产物的可溶性分析的SDS-PAGE电泳图，在图4中，KDa代表蛋白质的分子量(千道尔顿)；M2为蛋白质Marker ； 1为超声破碎表达菌体并离心后收集的上清液样品；2为为超声破碎表达菌体并离心后收集的沉淀样品。图5为亲和层析法纯化重组蛋白EC-proH印3的纯化图。在图5中，横坐标为流经纯化柱的溶液体积Volume (ml)；纵坐标为流出纯化柱后的溶液在280nm波长下的紫外吸收值Absorbance (mAU) ；a为流出组分，b为洗脱组分。图6为重组蛋白EC-proH印3纯化后的SDS-PAGE电泳图。在图6中，1为纯化过程中流出组分样品；2为纯化过程中洗脱组分样品；M2为蛋白质Marker ；KDa代表蛋白质的分子量(千道尔顿)。

一种斜带石斑鱼抗菌肽的原核表达产物及其制备方法，涉及生物技术领域中的鱼类基因工程表达。提供一种斜带石斑鱼抗菌肽的原核表达产物及其制备方法。构建的含有EC-hepcidin3基因的表达载体可在大肠杆菌中诱导表达，并通过高效纯化表达产物而在体外获得大量的表达产品。含有EC-hepcidin3基因的表达载体是在原核表达载体pET-28a+中插入EC-hepcidin3前体肽基因序列所构成的重组表达载体pET28a/EC-hepcidin3。在体外获得的表达产物，是重组表达载体pET28a/EC-hepcidin3在大肠杆菌中经诱导表达以及纯化后获得的重组蛋白EC-proHep3。