专利名称：用于rna提取的橡胶树叶片短期保存方法橡胶树(Hevea spp.)是大戟科(Euphorbiaceae)橡胶树属(Hevea)多年生的异花授粉乔木，为热带地区产胶的特种林木，是一类重要的经济作物。我国已具规模的天然橡胶基地主要分布在海南、云南和广东3省。从上世纪90年代开始，随着分子生物学的迅速发展，橡胶树的研究也逐渐进入分子水平。从转录水平上对橡胶树产量、抗逆、生长发育和代谢等相关基因表达及调控进行研究，是橡胶树表达数量性状基因座(expressionquantitative traitlocus, eQTL)定位、转基因育种、转基因品种鉴定、辅助育种等工作的 一种重要手段，而获取高质量的总RNA是开展分离基因和分析基因表达特性等分子生物学研究的重要基础。目前，提取橡胶树叶片基因组RNA的常规方法主要有热硼酸/蛋白酶K法和CTAB/酸酚法，两种方法所提RNA浓度和纯度均能达到后续的cDNA文库构建或PCR扩增等分子生物学实验的要求。离子型去污剂SDS、D0C和CTAB都是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。但用热硼酸/蛋白酶K法提取的RNA的纯度更高、质量更好，原因是橡胶树组织富含酚类物质，而选用硼酸缓冲液体系的RNA提取液有利于去除组织中的酚类物质，其中的硼酸可以与酚类化合物依靠氢键形成复合物，抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。在提取植物叶片RNA的研究中，常规方法多采用新鲜或冷冻的材料。提取RNA的材料应当尽量保持新鲜，样品保存的好坏，将直接影响RNA的提取效果。因此胶园采集新鲜材料时最好携带液氮罐、干冰箱、冰盒或冰桶，但在实际工作中，有时由于远距离采样无法携带液氮罐，而可携带的干冰箱、冰盒或冰桶的缺点是维持时间短，不能满足取样的需要，此时植物样品的保存成为决定其中的RNA的结构保持完整与否的一个关键步骤。冷冻是保持植物样品组织成分最有效的方式之一，目前冷冻主要集中在超低温保存，-80°C冰箱保存的样品所提的总RNA的质量和数量都与新鲜叶片相当。而野外携带液氮或干冰采样存在价格昂贵、罐体笨重、操作繁琐、易挥发、危险性高等缺点，未能达到简单、经济、安全、高效等效果。
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种用于RNA提取的橡胶树叶片短期保存方法，其利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现短时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存，有效地提高了样品RNA提取质量的保险性。本发明所采用的技术原理硼酸盐缓冲液(四硼酸钠，Sodium Borate, SBX,PH9. O)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，研究表明，提取缓冲液中含有的硼酸在弱碱性条件下可以与酚类以氢键形成复合物，抑制酚类物质的氧化及其与RNA的结合，同时具有防腐朽菌、蛀虫作用，用于橡胶木的浓度为30 50mM;EGTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制RNase活性；聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种高分子合成树脂，可溶于水、乙醇及氯仿，工业上常用作澄清剂、稳定剂，能络合多酚类物质，防止多酚物质氧化成醌类物质，避免溶液变褐而具有抗氧化作用；二硫苏糖醇(DTT)是常用还原剂，具有与β_巯基乙醇同样的抗氧化作用，可有效地防止橡胶树叶片中酚类物质的氧化，避免褐变，有助于酚的去除，但DTT和β -巯基乙醇相比，DTT的刺激性气味要小很多，毒性也比β -巯基乙醇低很多，而且DTT比β-巯基乙醇的浓度低7倍时，两者效果相近，仅DTT价格略高一些。蔗糖(Sucrose)为叶片提供碳源，离体叶片自养能力较差，就难免会影响其生理代谢，蔗糖经熬煮和高压灭菌后就会分解成叶片细胞能够直接吸收的葡萄糖和果糖形式。本发明所采用的技术方案一种用于RNA提取的橡胶树叶片短期保存方法，是采集处于小古铜期、大古铜期、变色期或淡绿期的橡胶树嫩叶，装进10 50ml离心管，分2次加入5 25ml储藏缓冲液，然后将离心管放入装有冰块、温度为O 4°C的冰盒或冰桶中，带回实验室后，搁置在温度为O 4°C的冰块上，待用。所述储藏缓冲液是将Sodium Borate、Na-EGTA, PVP-40、DTT和蔗糖加入到无菌水中配制而成，其中各组分的含量为Sodium Borate 150 250mM、Na EGTA 7· 5 12. 5mM、PVP 2 4% (ff / V),DTT 10 20mM、蔗糖 3 5% (W / V)，其中PVP、蔗糖含量为质量体积比含量。根据保存周期长短确定样品处理方式I、短期保存需将样品管装入封口袋内，写上标签，待所有样品处理完毕统一放置。对于试验安排在异地进行的研究，材料的寄送是不可缺少的一个环节，针对在RNA水平上进行基因组学研究的实验，只要将上述准备好的样品放置配备了冰袋的泡沫箱里(O 4 °C),盖严箱子，用胶带密封，即使路上耽误，高温天气，冰袋也溶化，一周后，收到的样品仍然保持绿色。2、长期保存倒去储藏缓冲液，旋紧管盖，放入盛有液氮的容器，该处理主要是保护RNA不降解，待所有样品充分冷冻后统一放置-70 -80°C冰箱；样品随时可取用，具备携带液氮取样_80°C保存或液氮冷冻过的新鲜叶片同样的效果。本发明利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现短时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存，具有工艺简单、成本低、效果好等特点，提高了样品RNA提取质量的保险性。图I为利用热硼酸/蛋白酶K法提取的橡胶树叶片组织总RNA电泳图谱。图中1为新鲜叶片，2为采用本发明方法短期保存叶片。图2为利用CTAB/酸酚法提取的橡胶树叶片总RNA效果检测图。图中1为采用携带液氮采样后经超低温长期保存的叶片，2为采用本发明储藏缓冲液短期保存及液氮速冻后经超低温长期保存的叶片。作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。一、缓冲液调配为提高储藏缓冲液的质量，缓冲液需要调配，对配方中五个主要因素各按三个水平进行试验(见表I)。寻求到最佳的水平组合，保证缓冲液有效、经济。采用该组配方配制叶片组织保存储藏缓冲液。储藏缓冲液配制后，在121°c的高压下蒸气灭菌15 min，但因DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，DTT配制后过滤除菌，PVP-40和DTT临用前加入储藏缓冲液。表I储藏缓冲液五因子正交试验设计表


本发明涉及一种用于RNA提取的橡胶树叶片短期保存方法，是采集处于小古铜期、大古铜期、变色期或淡绿期的橡胶树嫩叶，装进离心管中，加入储藏缓冲液，然后将离心管放入装有冰块、温度为0～4℃的冰盒或冰桶中，带回实验室后，搁置在温度为0～4℃的冰块上，待用。本发明利用储藏缓冲液与低温冷藏结合的方法保存橡胶树叶片组织，可有效地实现短时间保持橡胶树叶片的新鲜度，便于远距离采样、材料运输和贮存，具有工艺简单、成本低、效果好等特点，提高了样品RNA提取质量的保险性。