专利名称：利用双链rna干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法及其应用的制作方法烟碱，又叫尼古丁(nicotine)，属于吡啶族生物碱，是烟草中生物碱的主要成分，其含量高低和烟叶品质及其可用性关系十分密切，也是卷烟中主要的品质指标之一。优质烟叶中的烟碱含量一般在I. 5^3. 5%。烟叶烟碱含量低，烟气劲头小，香气少；烟碱含量高，烟气劲头过大，刺激性增强，产生辛辣味。在我国烤烟主产区，烟碱含量尤其是上部叶烟碱含量偏高的问题十分突出，由此对烤烟的销售、开发和生产产生严重不利影响。 烟碱的结构与人体内的化学信使物质こ酰胆碱十分相似，通过烟气进入人体后，90%在肺部吸收，进入血液后6秒钟即可到达大脑，可以起到こ酰胆碱相同的生理作用，能兴奋精神，消除疲劳，増加思维能力，提高工作效率。但过量的烟碱则起抑制和麻痹作用。经常吸入烟碱，使可參与反应的接受体数量上升，反应效果下降，被称作耐药性。这就意味着，为了达到同样的感知效果，吸烟者必须吸入更多的烟碱，从而造成吸烟成瘾，不断循环。烟瘾使吸烟者不得不经常吸烟，同时吸进很多有毒物质。另外，烟碱具有很强的毒性。中等剂量的烟碱能使人呼吸加快、血管舒张和呕吐明显加剧，稍大剂量的烟碱可引起震颤和痉挛。重度吸烟者吸入较多的烟碱后，表现为短暂的呼吸增强和血压上升，食欲減退。烟碱还会损害脑细胞，使吸烟者出现中枢神经系统和呼吸系统等一系列症状。烟碱及其衍生物能对“Akt ”分子通道起到激活作用，“Akt ”分子通道被激活后能促进细胞生长，对细胞“自杀”起到抑制作用，可能诱发细胞大量繁殖而导致癌症。烟碱的合成在烟草整个生育时期呈现上升趋势，从无到有，从少到多。种子中无烟碱，种子萌发IOOh后开始形成烟碱，移栽到现蕾期烟叶中烟碱积累缓慢，打顶后烟叶中烟碱积累迅速増加，直到成熟采收达到最大值。烟叶中烟碱合成量的高低与多种因素有关，如烟草品种的遗传特性、土壌肥力和PH值、海抜高度等。目前尚缺乏有效降低烟草烟碱的合成的措施。烟草烟碱的生物合成途径已基本阐明。烟碱的合成场所主要是烟草的根部。合成烟碱的直接前体物是烟酸和N —甲基吡咯烷盐。參与烟碱合成的酶主要有鸟氨酸脱羧酶(0DC)、腐胺N-甲基转移酶(PMT)和甲基腐胺氧化酶(MPO)等。Saunders和Bush (1979)报道，打顶后正常生物碱基因型的烟草中的PMT和MPO量増大，但在低生物碱基因型的烟草中，打顶后MPO并不增加。在几种相关和不相关的高和低生物碱基因型的烟草中，烟草根中的PMT活性与烟叶中的烟喊量成正比(Yoshida, 1973 ；Saunders和Bush, 1979)。Pudliner(1980)发现，在正常和低生物碱基因型烟草中的ODC和柠檬酸合成酶均増大，而柠檬酸合成酶是代谢作用的ー种指示剂。这些结果表明，PMT是该合成途径中限制作用最大的酶。将PMT反义基因导入烟草，已培育出烟碱含量可控制的转基因烟草品种。然而，由于转基因烟草品种在种植和食用中存在的较大风险，烟碱含量可控制的转基因烟草品种很难推广应用。RNA干扰(RNAinterference, RNAi)是1998年首次在秀丽线虫中发现并证明属于转录后水平的基因沉默机制(Fire et al.，1998)。其机理是利用生物体内的Dicer酶特异性地降解由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA(dsRNA)成为小干扰RNAs (small interfering RNAs, siRNAs), siRNA双链与诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex,RISC)结合后裂解为siRNA单链，与siRNA单链完全互补结合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，从而特异性地阻断其基因的表达。这种机制广泛存在于从真菌到植物、从无脊椎动物到哺乳动物的各种生物中。之后，该技术在动植物和微生物的功能基因组学研究、转基因育种等方面得到迅速应用。1998年，Timmons等发现在线虫中存在有体外使用dsRNA实现RNA干涉机制。2003年，Tenllado等应用在细菌体内大量表达的烟草病毒dsRNA喷施烟草表面，可高效防治烟草病毒病。我们根据该原理，将克隆得到的烟草PMT基因片段和dsRNA表达质粒一起构建ー个表达PMT基因片段的发卡dsRNA重组质粒，转化入RNaseIII缺陷型大肠杆菌菌株HTll (DE3)，通过大量培养工程菌株获得大量的PMT基 因片段的发卡dsRNA，将发卡dsRNA在烟草打顶前后喷施烟草，能够有效降低烟草烟碱的合成，生产出低含量烟碱的烟叶。该方法简便，高效和快捷，成本低，不需要构建转基因植株。这种方法既利用了 RNAi防治病毒病的特异性强、高效的特点，又不需构建转基因品种，是控制烟草烟碱合成的最佳途径。
本发明的目的是提供了ー种利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法及其应用，它可以有效降低烟草中的烟碱量。为解决上述技术问题，本发明提供ー种利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法，它包括以下步骤I)提取烟草的RNA，反转录得到烟草腐胺-N-甲基转移酶基因的cDNA ；2)利用PCR技木，以烟草腐胺-N-甲基转移酶基因的cDNA为模板，得到的烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断；3)将步骤2)中烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断连接到T载体上；4)将步骤3)中T载体上烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断连接到质粒载体PET-21a上，得到重组质粒PET-EH ；5)将步骤4)中得到重组质粒PET-EH转入到缺失RNAE3酶的大肠杆菌细胞中，6)将步骤5)中大肠杆菌细胞进行筛选，等到转化子；7)将步骤6)中转化子在LB液体培养基中扩大培养；8)将扩大培养的转化子采用超声波破碎，得到含有发卡dsRNA的破碎细胞溶液，即为dsRNA粗制剂；9)向步骤8)中dsRNA粗制剂中依次加入与dsRNA粗制剂溶液重量比为2 5%的甘油、O. 0Γ0. 1%的色氨酸和f 2%的聚こニ醇醚，然后搅拌均匀后分装，即可得到降低烟草烟碱合成的抑制剂，所述抑制剂中dsRNA浓度为25 40μ g/mL。进ー步地，所述步骤2)中，烟草腐胺-N-甲基转移酶基因片断的长度为30(T800bp。本发明还提供了一种所述降低烟草烟碱合成的抑制剂的应用。本发明有益效果I)本发明的生产简便、成本低廉、对人畜和高等动物无害，适于在烟草上大量施用，具有广阔的产业化前景。2)本发明克服了可湿性粉剂和乳油剂的缺陷，助剂易于分散，田间施用更方便，没有残留和环境污染。图I为本发明PET-EH载体图谱


本发明公开了一种利用双链RNA干扰技术制备降低烟草烟碱合成的抑制剂的方法及其应用，该方法先提取烟草的RNA，反转录得到烟草腐胺-N-甲基转移酶(PMT)基因的cDNA；然后利用PCR技术扩增该基因cDNA中的片断；然后连接在可表达RNA的质粒载体PET-21a中；将该质粒转入缺失RNAE3酶的大肠杆菌细胞中，表达发卡dsRNA；破碎细胞，得到dsRNA粗制剂，向dsRNA粗制剂中依次加入甘油、保护剂和分散剂，即可得到降低烟草烟碱合成的抑制剂。将得到抑制剂以5~15mL/株施于烟草上，降低烟草烟碱合成。本发明生产简便、成本低廉、对人畜和高等动物无害，适于在烟草上大量施用，具有广阔的产业化前景。