家兔血管内皮细胞rna提取与纯化的制作方法[0002]家兔动脉血管尽管比鼠类血管直径大，但是要得到足够的内皮细胞RNA却很困难。文献报道的酶解法和刮取法等，结果均不理想，很难避免平滑肌细胞的污染，而且RNA量很低，无法满足50种基因的PCR定量检测，如果要得到足够的高纯度的RNA标本，需要很多家兔才能满足需要，耗资较大(每只纯种家兔在美国需要200美元左右，完成7种血管的50种基因定量PCR测定，大约需要30-50只品种兔，花费在8000美元左右。为此，如何提取家兔血管内皮细胞RNA是亟待解决的问题。
[0003]本发明所要解决的技术问题在于提供一种家兔血管内皮细胞RNA提取方法，该方案提取率高，提取的RNA纯度高。[0004]本发明涉及一种家兔血管内皮细胞RNA提取方法，其特征在于包括如下步骤:[0005]首先从麻醉或者是屠宰的家兔体内获取7种不同的血管标本:左冠状动脉前降支、右冠状动脉、主动脉弓外环、主动脉弓内环、胸主动脉、腹主动脉、髂动脉；[0006]左、右冠状动脉:将心脏一分为二，左半侧有左冠状动脉前降支，右半侧有右冠状动脉，在动脉开口处的下方，水平剪开，用吸头的顶部连接27#针头和注射器，将血管用PBS溶液冲洗3次，从冠状动脉的上部开口处，加入Trizol溶液，用无菌离心管收集流出物，置于冰上；[0007]主动脉弓:将主动脉弯曲部分剪下,用PBS冲洗3次，去掉血块，从中线处剪开为外环和内环将内，外环放入培养皿中，顺着血管弯曲的走向分别加入Trizol溶液，冲洗3次，流出物分装入2个无菌离心管中，置于冰上；
[0008]胸、腹主动脉:隔肌以上为胸主动脉，隔肌以下为腹主动脉，分别用PBS冲洗3次，去掉血块，加入Trizol溶液冲洗2次，流出物分装入2个无菌离心管中，置于冰上；
[0009]髂动脉:从腹主动脉与髂动脉分叉处剪断，用PBS冲洗3次，去掉血块，加入Trizol溶液冲洗2次，流出物装入2个无菌离心管中，置于冰上；
[0010]上述分离到的样品内分别加入氯仿，混匀，室温存放3-5分钟，2-6℃离心13-17min，上清液中加入等体积的75%乙醇，混匀后将7种样品分别加入到质粒提取柱上，按质粒纯化步骤进行即得RNA。



[0011]图1A:家兔内皮细胞RNA纯度检测结果；
[0012]图1B、C:进行半定量RT-PCR检测内皮细胞基因的结果:R C右侧冠状动脉，L C左侧冠状动脉，I L髂动脉，O A主动脉弓外侧壁，IA主动脉弓内侧壁，A A腹主动脉，T A胸主动脉M:标准DNA ；
[0013]图2:家兔动脉内皮细胞有关基因的定量检测。

[0014]以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0015]首先获取家兔体内7种不同的血管标本:左冠状动脉前降支、右冠状动脉、主动脉弓外环、主动脉弓内环、胸主动脉、腹主动脉、髂动脉根部接近腹主动脉分支处。
[0016]*左、右冠状动脉:将心脏一分为二，左半侧有左冠状动脉前降支(LAD)，右半侧有右冠状动脉(RCA)，在动脉开口处的下方，水平剪开，便于流出物通过。用超细吸头(蛋白印迹上样用吸头)的顶部连接27#针头和Iml注射器，将血管用Iml冷PBS冲洗3次。从冠状动脉的上部开口处，加入500 μ I Trizol (Invitrogen),用1.5ml无菌离心管迅速收集流出物，每管约750 μ I。放冰上。
[0017]*主动脉弓:将主动脉弯曲部分剪下，即为主动脉弓，用2ml冷PBS冲洗3次，去掉血块。从中线处剪开为外环和内环。分别将内，外环放入4-5mm培养皿中，顺着血管弯曲的走向分别加入1000 μ I Trizol，快速冲洗三次，流出物分装入2个1.5ml无菌离心管中。放冰上。
[0018]*胸、腹主动脉:隔肌以上为胸主动脉，隔肌以下为腹主动脉。分别用3ml冷PBS冲洗3次，去掉血块。分别加入1500 μ I Trizol，快速冲洗二次，流出物分装入2个1.5ml无菌离心管中。放冰上。
[0019]*髂动脉:从腹主动脉与髂动脉分叉处向上0.5cm处剪断。用2ml冷PBS冲洗3次，去掉血块。加入1000 μ I Trizol，快速冲洗二次，流出物分装入2个1.5ml无菌离心管中。放冰上。`
[0020]上述分离到的样品内分别加入200 μ I氯仿，混匀，室温存放3-5分钟，4 °C离心15min。上清液中加入等体积的75%乙醇(用DEPC处理的水配制)，总体积约为700-800 μ 1，混匀后全部加入到质粒提取柱上，按质粒纯化步骤进行，将含有RNA样品的纯化柱放在2ml收集管内，14000rpm、离心I分钟，弃去废液；加入PB液500 μ 1,14000rpm>离心I分钟，弃去废液；加入PE液750 μ 1，HOOOrpm、离心I分钟，弃去废液；然后空离14000rpm、l分钟以便除去残留的水分，弃去废液。将吸附柱移至干净的1.5ml离心管内，往吸附柱膜中央滴加30 μ I纯净水，室温静置I分钟，14000 rpm、离心I分钟，收集到的洗脱液即为样品RNA，得到RNA产量高，纯度好。回收率高，扩增的PCR条带很清晰(样品2)。[0021 ] 根据家兔VWF与GAPDH及小鼠MHC-SM序列所设计的PCR引物，可以扩增出清晰的单一条带，与预期大小相同(参见图1A)，可以满足检测SMC细胞污染的要求。每个血管内皮细胞的RNA样品收集3份以上(样品2)进行扩增。若GAPDH检测为阳性，说明有细胞洗出；VWF为内皮细胞特异性标志物，若检测出VWF阳性，说明洗出的细胞中含有内皮细胞；而检测出MHC(Myosin heavy chain)则说明有平滑肌细胞污染，该样品将弃用。
[0022]初步检测显示(图1B、C)，与右侧冠状动脉内皮细胞比较，在左侧冠状动脉内皮细胞表达较高的基因有:ET1、VEGF、CD44、ADFP、SPP1、RXRA、CCL2等；与左侧冠状动脉内皮细胞比较，在右侧冠状动脉内皮细胞表达较高的基因有:eN0S，C0X2、THBD、AP0A1、S0D2、FAS ；由于左侧冠状动脉易于出现动脉粥样硬化，所以有待进一步确认，在左侧冠状动脉内皮细胞表达较高的基因是否就是动脉粥样硬化易感基因即ET1、VEGF,⑶44、ADFP, SPPURXRA、CCL2等有可能为左侧冠状动脉易于出现动脉粥样硬化的原因之一。
[0023]血管内皮细胞的RNA，用生物芯片技术(PCRarray)，作大量基因的定量分析。初步结果显示，很多基因如，eN0S、ETl、C0X2、Angpt2、PRDX2、KLF2、BMP4的表达在不同的血管，如左冠状动脉前降支LC，右冠状动脉RC，主动脉弓外侧壁0A，内侧壁IA，胸主动脉等均有不同的表达水平(参见图2)[0024]当理解的是，本发明的具体实施例仅仅是出于示例性说明的目的，其不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的技术人员可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。