专利名称：皮肤与纤维化症候中的rna干扰的制作方法互补寡核苷酸序列是前景光明的治疗剂以及在阐明基因功能方面的有用研究工具。然而，现有技术中寡核苷酸分子罹受一些问题，这些问题可以阻碍它们的临床开发，并且频繁地使得在体内使用此类组合物难以达到预期的有效的基因表达(包括蛋白合成)抑制。 一个主要问题是这类化合物至细胞与组织的递送。常规的双链RNAi化合物(19-29个碱基长)形成一种高度带负电的大约1.5nm乘10_15nm大小的刚性螺旋。这种杆条式分子不能通过细胞膜并且结果是在体外以及体内具有极其有限的效能。结果，所有常规的RNAi化合物都要求某种类型的递送载体以促进其组织分布与细胞吸收。这被认为是RNAi技术的一个主要限制。已经存在许多尝试来对寡核苷酸应用化学修饰以改进其细胞吸收特性。此种修饰之一是将一种胆固醇分子附接至该寡核苷酸上。这种方法首先由Letsinger等人在1989年报道。之后，ISIS制药公司(ISIS Pharmaceuticals, Inc.)(卡尔斯巴德,加利福尼亚(Carlsbad，CA))报道了在将该胆固醇分子附接至该寡核苷酸方面的更先进的技术(Manoharan,1992)。随着九十年代后期siRNAs的发现，在这些分子上进行了类似类型的修饰以增强其递送特征曲线(profile)。在文献中出现了共轭至轻度修饰(Soutschek, 2004)以及重度修饰(Wolfrum, 2007)的siRNAs上的胆固醇分子。Yamada等人，2008还报道了进一步改进胆固醇介导的siRNAs吸收的高级连接物化学物质的用途。尽管所有这类努力，在生物流体的存在下这些类型的化合物的吸收似乎受到抑制，导致体内基因沉默的效能高度受限，由此限制了这些化合物在临床环境中的应用。发明概述在此描述了 sd-rxRNA分子至皮肤的有效体内递送以及此类分子用于基因沉默的用途。这一类别的RNAi比前述RNAi分子具有优异的体外以及体内效能。与本发明相关的分子作为跟受损皮肤以及纤维化有关的失调或疾患的疗法具有广泛潜力。本发明的多个方面涉及包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该反义链是与从表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17以及23内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸互补，并且其中该dsRNA是一种sd-rxRNA。本发明的另外的方面涉及包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该正义链和/或该反义链包含从表1-27内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸，并且其中该dsRNA是一种sd-rxRNA。本发明的另外的方面涉及包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该反义链是与从表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17以及23内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸互补，并且其中该dsRNA是一种rxRNAori。本发明的另外的方面涉及包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)，其中该正义链和/或该反义链包含从表1-27内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸，并且其中该dsRNA是一种rxRNAori。在一些实施方案中，该dsRNA是针对CTGF。在一些实施方案中，该dsRNA的反义链是与从表11、12以及15内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，该正义链和/或该反义链包含从表10、11、12、15、20以及24内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中，该正义链包含选自下组的一种序列的至少12个连续核苷酸，该组由以下项组成:SEQ ID N0s:2463、3429、2443、3445、2459、3493、2465 以及 3469。在一些实施方案中，该反义链包含选自下组的一种序列的至少12个连续核苷酸，该组由以下项组成:2464、3430、4203、3446、2460、3494、2466 以及 3470。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO: 2463并且该反义链包含SEQ IDNO:24640在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:3429并且该反义链包含SEQ IDNO:3430。 在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2443并且该反义链包含SEQ IDNO:4203。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO: 3445并且该反义链包含SEQ IDNO:3446。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2459并且该反义链包含SEQ IDNO: 2460。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO: 3493并且该反义链包含SEQ IDNO:3494。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2465并且该反义链包含SEQ IDNO:24660在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:3469并且该反义链包含SEQ IDNO:3470。在一些实施方案中，该正义链包含选自下组的一种序列的至少12个连续核苷酸，该组由以下项组成:SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。在某些实施方案中，该正义链包含一种选自下组的序列，该组由以下项组成=SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。在一些实施方案中，该dsRNA是经疏水修饰。在某些实施方案中，该dsRNA是连接至一种疏水轭合物。本发明的多个方面涉及包含在此描述的dsRNA分子的组合物。在一些实施方案中，该组合物包含针对为多于一种的蛋白进行编码的多种基因的dsRNA。在一些实施方案中，该组合物是配制用于递送至皮肤。在某些实施方案中，该组合物是以一种中性配制品形式。在一些实施方案中，该组合物是配制用于局部递送或用于皮内注射。本发明的多个方面涉及包括以下的方法:将在此描述的任何dsRNA或包含在此描述的任何dsRNA的组合物递送至对其有需要的受试者的皮肤。本发明的多个方面涉及包括以下的方法:将一种治疗有效量的包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)给予对其有需要的受试者，其中该反义链是与从表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17以及23内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸互补，并且其中该dsRNA是一种sd-rxRNA。本发明的另外的方面涉及包括以下的方法:将一种治疗有效量的包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)给予对其有需要的受试者，其中该正义链和/或该反义链包含从表1-27内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸，并且其中该dsRNA是一种 sd-rxRNA。本发明的另外的方面涉及包括以下的方法:将一种治疗有效量的包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)给予对其有需要的受试者，其中该反义链是与从表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17以及23内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸互补，并且其中该dsRNA是一种rxRNAori。本发明的另外的方面涉及包括以下的方法:将一种治疗有效量的包含正义链以及反义链的双链核糖核酸(dsRNA)给予对其有需要的受试者，其中该正义链和/或该反义链包含从表1-27内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸，并且其中该dsRNA是一种 rxRNAori。在一些实施方案中，该方`法是一种用于治疗受损皮肤方法。在一些实施方案中，该方法是一种用于治疗或预防纤维化失调的方法。在一些实施方案中，该dsRNA是经由皮内注射而给予。在一些实施方案中，该dsRNA是局部给予至皮肤。在一些实施方案中，同时地或相继地给予两种或更多种核酸分子。在一些实施方案中，这些dsRNA中的一种或多种是经疏水修饰。在某些实施方案中，这些dsRNA中的一种或多种是连接至一种疏水轭合物。在一些实施方案中，该dsRNA是针对CTGF。在某些实施方案中，该dsRNA的反义链是与从表11、12以及15内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸互补。在一些实施方案中，该正义链和/或该反义链包含从表10、11、12、15、20以及24内的序列中选择的一种序列的至少12个连续核苷酸。在一些实施方案中，该正义链包含选自下组的一种序列的至少12个连续核苷酸，该组由以下项组成:SEQ ID N0s:2463、3429、2443、3445、2459、3493、2465 以及 3469。在某些实施方案中，该反义链包含选自下组的一种序列的至少12个连续核苷酸，该组由以下项组成:2464、3430、4203、3446、2460、3494、2466 以及 3470。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2463并且该反义链包含SEQ IDNO: 2464。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO: 3429并且该反义链包含SEQ IDNO:3430。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2443并且该反义链包含SEQ IDNO:42030在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:3445并且该反义链包含SEQ IDNO:3446。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2459并且该反义链包含SEQ IDNO: 2460。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO: 3493并且该反义链包含SEQ IDNO:3494。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO:2465并且该反义链包含SEQ IDNO: 2466。在某些实施方案中，该正义链包含SEQ ID NO: 3469并且该反义链包含SEQ IDNO:3470。在一些实施方案中，该正义链包含选自下组的一种序列的至少12个连续核苷酸，该组由以下项组成:SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。在一些实施方案中，该正义链包含一种选自下组的序列，该组由以下项组成=SEQ ID NOs: 1835、1847、1848以及1849。本发明的多个方面涉及治疗或预防纤维化失调。在一些实施方案中，该纤维化失调是选自下组，该组由以下项组成:弥漫间质性肺纤维化、肝硬化、硬皮病与肾小球肾炎、肺纤维化、肝纤维化、皮肤纤维化、肌肉纤维化、辐射纤维化、肾纤维化、增殖性玻璃体视网膜病变、再狭窄与子宫纤维化以及由于瘢痕的小梁切除术失败。 在一些实施方案中，该dsRNA是经由皮内注射而给予，而在其他实施方案中，皮下地或皮表地给予一种或多种dsRNA。可以在医疗程序之前、之中和/或之后给予一种或多种dsRNA。在一些实施方案中，在该医疗程序之前8天之内或之后8天之内进行给予。在一些实施方案中，该医疗程序是手术。在某些实施方案中，该手术是选择性的。在一些实施方案中，该手术包括上皮移植或皮肤移植。在一些实施方案中，将一种或多种双链核酸分子给予至移植供体位点和/或移植受体位点。`本发明的多个方面涉及用于在损伤之前、之中和/或之后给予一种或多种dsRNA的方法。在一些实施方案中，该受试者具有一种创伤，比如一种慢性创伤。在某些实施方案中，该创伤是选择性手术的结果。该创伤可以是外部的或内部的。在一些实施方案中，该dsRNA是在烧伤之后给予。在此描述的方法包括用于促进创伤愈合的方法以及用于预防瘢痕的方法。在一些实施方案中，给予受试者的一种或多种dsRNA是针对选自下组的基因，该组由以下项组成:TGFB1、TGFB2、hTGFB 1、hTGFB2、PTGS2、SPP1、hSPP 1、CTGF 或 hCTGF。在一些实施方案中，在该受试者的皮肤上给予这一种或多种dsRNA。在某些实施方案中,这一种或多种dsRNA分子是以乳膏或软膏的形式。在一些实施方案中，给予两种或更多种或者三种或更多种核酸分子。可以同时地或相继地给予两种或更多种核酸分子。本发明的多个方面涉及经优化的核酸。在一些实施方案中，一种或多种双链核酸分子是经疏水修饰。在某些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子是连接至一种疏水轭合物或多种疏水轭合物。在一些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子是连接至一种亲脂性基团。在某些实施方案中，该亲脂性基团是连接至该一种或多种双链核酸分子的过客链。在一些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子是连接至胆固醇、一种长链烷基胆固醇类似物、维生素A或维生素E。在一些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子是附接至氯甲酸酯。
本发明的多个方面涉及通过修饰而经优化的核酸。在一些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子包括至少一个2’0甲基或2’氟修饰和/或至少一个5甲基C或U修饰。在一些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子具有一种16-28个核苷酸长度的引导链。在某些实施方案中，该一种或多种双链核酸分子的核苷酸的至少40%是经修饰的。在此描述的双链核酸分子还可以附接至一种连接物。在一些实施方案中，该连接物是可质子化的。本发明的多个方面涉及包含至少两个单链区域的双链核酸分子。在一些实施方案中，这些单链区域包含硫代磷酸酯修饰。在某些实施方案中，这些单链区域是位于该引导链的3’末端以及该过客链的5’末端。本发明的多个方面涉及用于将一种核酸递送至受试者的方法，这些方法包括在医疗程序之前的8天之内将一种或多种治疗受损皮肤有效量的sd-rxRNA给予受试者。对于本发明的限制各自可以涵盖本发明的不同的实施方案。因此，预期到涉及任何一个要素或要素组合的对于本发明的限制各自可以包括在本发明的各方面中。本发明在其应用方面不限于以下描 述中所提出的或图中所展示的构造详情和组成部分的安排。本发明可以具有其他实施方案并且能以不同的方法被实行或执行。附图简要说明附图并不是按比例绘制。在这些附图中，在不同图中示出的各个相同或接近相同的组成部分用一种相似数字符号表示。为了简明的目的，不是每一组成部分都在每一附图中做了标记。附图中:

图1展示了靶标基因的非限制性实例的表达谱(profile)，这些基因包括MAP4K4、SPPl、CTGF、PTGS2以及TGFB1。按照预期，靶标基因表达在早期升高并且到第10天回归正图2展示的图表描述了在皮内注射之后使组织可视化的实验方法。图3展示了在皮内注射靶向MAP4K4的sd-rxRNA之后MAP4K4的沉默。图4展示了在皮内注射靶向MAP4K4、PPIB以及CTGF的sd-rxRNA分子之后每一基因的沉默。图5展示了在皮内注射靶向MAP4K4的sd-rxRNA之后MAP4K4的沉默。展示了相对于对照而标准化的MAP4K4表达。图6展示了在皮内注射靶向PPIB的sd-rxRNA之后PPIB的沉默。展示了相对于对照而标准化的PPIB表达。图7展示了在皮内注射靶向PPIB的sd-rxRNA之后PPIB沉默的持续时间。图8展示了在皮内注射靶向MAP4K4的sd-rxRNA之后MAP4K4沉默的持续时间。图9展示了利用两种不同剂量方案而达到的等同性沉默。图10展示了对于基因沉默有效的、靶向CTGF的sd-rxRNA分子的实例。图11展示了对于基因沉默有效的、靶向CTGF的sd-rxRNA分子的实例。图12展示了靶向CTGF的sd-rxRNA分子的剂量响应。图13展示了原始sd-rxRNA筛选的样本。图14展示了来自该原始sd-rxRNA筛选的符合(hit)数据。图15展示了在给予靶向PTGS2的sd-rxRNA之后PTGS2的基因表达。图16展示了在给予靶向hTGFBl的sd-rxRNA之后hTGFBl的基因表达。
图17展示了在给予靶向hTGFBl的sd-rxRNA之后hTGFBl的基因表达。图18展示了 TGFBl sd-rxRNA筛选的结果。图19展示了在给予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表达。图20展示了在给予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表达。图21展示了在给予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表达。图22展示了在给予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表达。图23展示了在给予靶向TGFB2的sd-rxRNA之后TGFB2的基因表达。图24展示了 TGFB2 sd-rxRNA筛选的结果。图25展示了有效力的hSPPl sd-rxRNA的鉴别。图26展示了有效力的hSPPl sd-rxRNA的鉴别。图27展示了有效力的hSPPl sd-rxRNA的鉴别。图28展示了 SPPl sd-rxRNA复合物选择。图29展示了连接物化学物质的变体不影响体外sd-rxRNA的沉默活性。利用被动吸收测试在多种sd-rxRNA上(祀向Map4k4或PPIB)对两种不同的连接物化学物质(轻脯氨酸连接物以及ribo连接物)进行了评估以确定有利于自身递送的连接物。不存在递送载体(被动转染)情况下，用luM、0.1uM或0.0luM的sd-rxRNA转染海拉细胞持续48hrs。任一连接物的使 用导致sd-rxRNA的有效递送。图30描述了纤维化途径中作为中心因子的CTGF。图31描述了创伤愈合各阶段。图32描述了 sd-rxRNA前导的化学优化。图33展示了经化学优化的CTGF LI sd-rxRNA是活性的。图34展示了经化学优化的CTGF LI sd-rxRNA的体外效能。图35展示了经化学优化的CTGF LI sd-rxRNA的体外稳定性。图36展示了经化学优化的CTGF L2 sd-rxRNA是活性的。图37展示了经化学优化的CTGF L2 sd-rxRNA的体外效能。图38展示了经化学优化的CTGF L2 sd-rxRNA的体外稳定性。图39提供了在体内具有活性的复合物的总结。图40展示了用CTGF LlB靶标序列进行处理导致mRNA沉默。图41展示了用CTGF L2靶标序列进行处理导致mRNA沉默。图42展示了 RX1-109的两种皮内注射之后的CTGF沉默。图43展示了在SD大鼠中皮内注射该sd-rxRNA之后皮肤中CTGF沉默的持续时间。获取八毫米的皮肤活检，并且将mRNA水平通过QPCR进行量化并且标准化为一种管家基因。显示的是与非靶标对照(NTC)相比的沉默百分数(%);每一时间点处的PBS是一个实验组；*p < 0.04 ;**p < 0.002。图44展示了经化学优化的CTGF L3 sd-rxRNA是活性的。图45展示了 CTGF L4 sd-rxRNA的绝对发光。图46展示了经化学优化的CTGF L4 sd-rxRNA是活性的。图47展示了在SD大鼠中皮内注射CTFG sd-rxRNA之后皮肤中CTGF、α -SM肌动蛋白、胶原1Α2以及胶原3Α1的mRNA表达水平的变化。通过qPCR对mRNA水平进行量化。
图48展示了用靶向CTGF的sd-rxRNA进行处理，在创伤愈合方面没有明显延迟。用靶向CTGF以及靶向C0X2的sd-rxRNA组合进行处理，观察到一些变化。图49展示了 Sd-rxRNA的给予在经过至少9天的过程中降低了创伤宽度。图表显示了在大鼠中于创伤后3天、6天以及9天时对创伤的显微测量。每一组代表5只大鼠。对每一创伤的两个非连续切片进行测量并且计算每一创伤的这两个切片的平均宽度。*P〈0.05相对于PBS —种NTC。图50展示了 sd-rxRNA的给予在经过至少9天的过程中降低了创伤面积。图表显示了在大鼠中于创伤后3天、6天以及9天时对创伤的显微测量。每一组代表5只大鼠。对每一创伤的两个非连续切片进行测量并且计算每一创伤的这两个切片的平均宽度。*P〈0.05相对于PBS —种NTC。图51展示了 sd-rxRNA的给予在经过至少9天的过程中提高了创伤重新形成上皮的百分数。图表显示了在大鼠中于创伤后3天、6天以及9天时对创伤的显微测量。每一组代表5只大鼠。对每一创伤的两个非连续切片进行测量并且计算每一创伤的这两个切片的平均宽度。*p〈0.05相对于PBS—种NTC。图52展示了 sd-rxRNA的给予在经过至少9天的过程中提高了平均的肉芽组织成熟度评分。图表显示了在大鼠中于创伤后3天、6天以及9天时对创伤的显微测量(5=成熟，1=未成熟)。每一组代表5只大鼠。图53展示了第9天创伤中的⑶68标记(0=无标记，3=实质性标记)。每一组代表5只大鼠。 图54展示了各CTGF前导在体外具有不同的毒性水平。图55展示了 RXI 109剂量按比例增加之后细胞活力的百分比(%)(寡核苷酸配制在PBS中)。图56是阶段I以及2临床试验设计的示意图。图57是阶段I以及2临床试验设计的示意图。图58展示了在肝中相对于PBS对照的PPIB表达的减少百分数(%)。通过单一的尾部静脉注射将配制了类脂的rxRNA(10mg/kg)全身性地递送至Balb/c小鼠(n=5)。在注射之后24小时处获取肝组织并且通过qPCR对表达进行分析(标准化为β_肌动蛋白)。Map4K4 rxRNAori也显示出显著的沉默(约83%，p〈0.001)，尽管Map4K4 sd-rxRNA没有显著地减少靶标基因表达(约17% p=0.019)。TD.035.2278，公开的类脂递送试剂，98N12-5 (I)，来自Akinc公司，2009。图59展示了经化学优化的PTGS2L1 sd-rxRNA是活性的。图60展示了经化学优化的PTGS2L2 sd-rxRNA是活性的。图61展示了经化学优化的hTGFBlLl sd-rxRNA是活性的。图62展示了经化学优化的hTGFBlLl sd-rxRNA是活性的。图63展示了经化学优化的hTGFB2Ll sd-rxRNA是活性的。图64展示了经化学优化的hTGFB2 sd-rxRNA是活性的。详细说明本发明的多个方面涉及残余基因沉默的方法与组合物。本发明至少部分地基于以下出人意料的发现:将sd-rxRNA分子给予至皮肤，比如通过皮内注射或皮下注射，在皮肤中产生基因表达的有效沉默。在此还通过基于细胞的筛选对高效力的靶向多种基因的sd-rxRNA 分子进行了鉴别，这些基因包括 SPPl、CTGF、PTGS2、TGFBl 以及 TGFB2。sd-rxRNA代表了一种新类别的治疗性RNAi分子，它们在治疗受损皮肤中具有显著潜力。sd-rxRNA 分子本发明的多个方面涉及sd-rxRNA分子。如在此使用的sd-rxRNA”或“sd-rxRNA分子”指一种自我递送RNA分子，比如描述于2009年9月22日提交的题为“小化的自我递送 RNAI 复合物”(“REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS.”)的 PCT