专利名称：使用了微小rna的心肌细胞的增殖方法成体的心肌细胞由于已经丧失了细胞分裂能力，因而一旦因暴露于缺血或心肌炎等各种刺激下坏死或丧失，则无法补充。其结果，残存的心肌细胞通过代偿性肥厚以期保护心脏机能，但若该状态持续、超出了心肌组织的允许范围，则引起进ー步的心肌细胞的疲惫、死亡，最終呈现心肌机能的降低，即心カ衰竭。以心力衰竭为首的心脏病成为日本死亡原因的第2位。另 外，心脏病患者的预后非常差，5年生存率只不过50%左右。因此认为，从医疗福利以及医疗经济的观点来看，有效的心カ衰竭治疗方法的开发是非常有益的。作为迄今为止的心カ衰竭治疗药，逐渐使用増加心肌收缩カ的洋地黄制剂、黄嘌呤制剂等强心剂，但已知，若长时间投与这些药剂，有时反而会恶化病情。另外，最近，利用^阻断药、ACE抑制剂等减轻由交感神经系统、肾素-血管紧张素系统的亢奋所导致的过剩的心脏负荷的药剂的治疗逐渐成为主流，但这些不过是对症的治疗法，无法恢复受到伤害的心脏组织本身。另ー方面，心脏移植为对重症心力衰竭的根本的治疗法，但从脏器提供者的不足、医疗伦理、给患者的肉体带来的负担或经济的重担等问题出发，难以使用本法作为通常的治疗法。微小RNA (以下称为“miRNA”)为存在于细胞内的长度21 25个碱基的非编码RNA。广泛保存于线虫至哺乳类，作为在生物体内的各种基因的表达调节方面担负重要作用的分子，近年来备受注目。miRNA由存在于基因组DNA上的miRNA基因首先以数百至数千个碱基左右的miRNA初级转录产物(pri-miRNA)的形式被转录。接着，在核内由被称作Drosha的RNaseIII酶加工，变成约70个碱基左右的具有发卡结构的前体miRNA (pre-miRNA)0之后由Exportin-5从核运送到细胞质中，受到被称作Dicer的RNase III酶的加工,变成21 25个碱基的双链的成熟型miRNA (mature miRNA)。已知，成熟型miRNA的其中的一条链与被称作RNA诱导沉默复合体(RISC)的蛋白质形成复合体，与具有互补序列的目标基因的mRNA结合，抑制目标基因的表达(非专利文献1、2)。推测每I个生物物种存在1000种左右的miRNA，据说它们分别调节多个目标基因的表达，控制着编码蛋白质的基因的总体的约1/3 (非专利文献3)。另外，逐渐清楚了miRNA參与发生、分化、病毒感染时的生物体反应等，也暗示其与人的疾病有关。特别是关于癌与miRNA的关系，由于正常组织和癌组织中存在较多表达方式不同的miRNA，因此强烈启示miRNA參与癌变过程，报道存在促进癌变的miRNA、抑制肿瘤的miRNA两者(非专利文献4、5、6)。另外，作为心脏病相关信息，很多研究小组报道了正常心脏和病变心脏中的miRNA的表达谱解析。其中一部分解析了具体的机能，例如报道了，心脏肥厚时miR-195的表达增力口，强制表达该miRNA的转基因小鼠的心脏肥厚，引起了扩张型心肌病、心力衰竭(专利文献I、非专利文献7);另外报道了，作为心脏肥厚时表达减少的miRNA的miR-1抑制心肌细胞的增殖(专利文献2、非专利文献8)等。现有技术文献专利文献专利文献1:W02009/062169 专利文献2:冊2006/107826非专利文献非专利文献l:He & Hannon, Nature Reviews Genetics, 5:522-531，(2004)非专利文献2:Bartel, Cell, 116:281-297，(2004)非专利文献3:Berezikov et al. , Cell, 120:21-24, (2005)非专利文献4: Esquela-Kerscher & Slack, Nature ReviewsCancer, 6:259-269, (2006)非专利文献5:Kent & Mendell, Oncogene, 25:6188-6196，(2006)非专利文献6: Zhang et al. , Developmental Biology, 302:1-12, (2007)非专利文献7:van Rooij et al. , Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America, 103:18255-18260，(2006)非专利文献8:Zhao et al.，Cell, 129:303-317，(2007)
发明要解决的问题本发明的课题在于鉴定促进心肌细胞的增殖的miRNA并提供一种使用该miRNA的心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物等。用于解决问题的方案为了解决上述课题，本发明人等着眼于作为调节心肌细胞增殖因子的微小RNA(以下称为“miRNA”)而进行研究，进行有关调节心肌细胞的增殖的miRNA的解析。并且，进行深入研究，结果，本发明人等成功地鉴定了调节心肌细胞的增殖的多个miRNA，从而完成了本发明。作为本发明的第I方式，本发明人等提供具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA。更具体而言，本发明的miRNA包括以下的方式(1-1)具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA。(1-2)根据上述(1-1)所述的miRNA，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(1-3)根据上述(1-1)或(1-2)所述的miRNA，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO: I或SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质。(1-4)根据上述(1-3)所述的miRNA，其中，包含由SEQ ID N0:1构成的种子序列的物质为选自由 miR-148a (SEQ ID NO:3)、miR_148b (SEQ ID NO:5)、miR-152 (SEQ IDNO: 7)及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(1-5)根据上述(1-3)所述的miRNA，其中，包含由SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373 (SEQ ID N0:9)及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。作为本发明的第2方式，本发明人等提供了具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的药物用途，所述药物用途可以记载为如下形式Ca) 一种用于治疗心脏病的药物组合物，其使用了上述规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸；(b)—种心脏病的治疗方法，其特征在于，将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位，从而使心肌细胞在该部位增殖；(c) 一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸在制造用于治疗心脏病的药物中的用途；或((1) 一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，其在心脏病的治疗中使用。本发明中“规定miRNA的核酸”是指用于使(i )成熟型miRNA及该miRNA的前体以及它们的突变体及类似物或(ii )成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物在生物体内或细胞内表达的表达载体。 关于上述方式中(a)的药物组合物的发明，更具体而言,这样的药物组合物包含以下的方式(2-a-l) —种心脏病治疗用药物组合物，其含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。(2-a_2)根据上述(2-a-l)所述的药物组合物，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-a-3)根据上述(2_a_l)或(2_a_2)所述的药物组合物，其中，miRNA为包含由SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: 2构成的种子序列的物质。(2-a_4)根据上述(2-a_3)所述的药物组合物，其中，包含由SEQ ID N0:1构成的种子序列的物质为选自由 miR-148a (SEQ ID NO:3)、miR_148b (SEQ ID NO:5)、miR-152(SEQ ID N0:7)及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-a_5)根据上述(2-a_3)所述的药物组合物，其中，包含由SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373 (SEQ ID NO:9)及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。(2-a_6)根据上述(2-a-l) (2_a_5)中任一项所述的药物组合物，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体或脂质体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。(2-a-7)根据上述(2-a_6)所述的药物组合物，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。(2-a_8)根据上述(2_a_7)所述的药物组合物，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒(HVJ ;别名，仙台病毒)载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体(chick poxviral vectors)、乳多空病毒载体中的病毒载体。(2-a-9)根据上述(2_a_l) (2_a_8)中任一项所述的药物组合物，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键(modified internucleoside linkage)、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。(2-a-10)根据上述(2_a_l) (2_a_9)中任一项所述的药物组合物，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。另外，关于上述方式中(b)的治疗方法的发明，更具体而言，这样的治疗方法包含以下的方式(2-b-l) —种心脏病的治疗方法，其特征在于，通过将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位，从而使心肌细胞在该部位增殖。(2-b-2)根据上述(2-b-l)所述的治疗方法，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。 (2-b_3)根据上述(2-b-l)或(2-b_2)所述的治疗方法，其中，miRNA为包含由SEQID NO: I或SEQ ID NO: 2构成的种子序列的物质。(2-b_4)根据上述(2-b_3)所述的治疗方法，其中，包含由SEQ ID N0:1构成的种子序列的物质为选自由 miR-148a (SEQ ID NO:3)、miR_148b (SEQ ID NO:5),miR-152 (SEQID NO: 7)及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-b_5)根据上述(2-b_3)所述的治疗方法，其中，包含由SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373 (SEQ ID NO:9)及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。(2_b_6)根据上述(2-b-l) (2_b_5)中任一项所述的治疗方法，其中，通过表达载体或脂质体将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入个体心脏的损伤部位。(2-b-7)根据上述(2-b_6)所述的治疗方法，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。(2-b_8)根据上述(2-b_7)所述的治疗方法，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒(HVJ ;别名，仙台病毒)载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。(2-b-9)根据上述(2-b-l) (2-b_8)中任一项所述的治疗方法，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。(2-b-10)根据上述(2-b-l) (2_b_9)中任一项所述的治疗方法，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。另外，关于上述方式中(C)的用途发明，更具体而言，这样的用途包括以下的方式(2-c-l) —种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸在制造心脏病治疗用药物组合物中的用途。(2-C-2)根据上述(2-c-l)所述的用途，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-C-3)根据上述(2-c-l)或(2-C-2)所述的用途，其中，miRNA为包含由SEQ IDNO: I或SEQ ID NO: 2构成的种子序列的物质。(2-C-4)根据上述(2-C-3)所述的用途，其中，包含由SEQ ID N0:1构成的种子序列的物质为选自由 miR-148a (SEQ ID NO:3)、miR_148b (SEQ ID NO:5),miR-152 (SEQ IDN0:7)及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-C-5)根据上述(2-C-3)所述的用途，其中，包含由SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373 (SEQ ID NO:9)及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。(2-(3_6)根据上述(2-(-1) (2-C-5)中任一项所述的用途，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体或脂质体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。(2-C-7)根据上述(2-C-6)所述的用途,其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。 (2-C-8)根据上述(2-C-7)所述的用途，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒(HVJ ;别名，仙台病毒)载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。(2-C-9)根据上述(2-c-l) (2_c_8)中任一项所述的用途，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。(2-c-lO)根据上述(2-c-l) (2-C-9)中任一项所述的用途，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。进而，关于上述方式中(d)的核酸的发明，更具体而言，这样的核酸包括以下的方式(2-d-l) 一种规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸，其在心脏病的治疗中使用。(2-d-2)根据上述(2-d-l)所述的核酸，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-d-3)根据上述(2-d-l)或(2-d-2)所述的核酸，其中，miRNA为包含由SEQ IDNO: I或SEQ ID NO: 2构成的种子序列的物质。(2-d-4)根据上述(2-d-3)所述的核酸，其中，包含由SEQ ID N0:1构成的种子序列的物质为选自由 miR-148a (SEQ ID NO:3)、miR_148b (SEQ ID NO:5),miR-152 (SEQ IDN0:7)及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(2-d-5)根据上述(2-d-3)所述的核酸，其中，包含由SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373 (SEQ ID NO:9)及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。(2-d_6)根据上述(2-d-l) (2-d_5)中任一项所述的核酸，其以用于将其导入心肌细胞内并使其表达的表达载体或脂质体形式，含有规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸。(2-d-7)根据上述(2-d-6)所述的核酸，其中，载体为病毒载体或非病毒性表达载体。(2-d-8)根据上述(2-d-7)所述的核酸，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒(HVJ ;别名，仙台病毒)载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。(2-d-9)根据上述(2-d-l) (2-d-8)中任一项所述的核酸，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修 饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。(2-d-10)根据上述(2-d-l) (2-d-9)中任一项所述的核酸，其中，心脏病为心肌梗塞、缺血性心脏病、充血性心力衰竭、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、心肌炎或慢性心力衰竭。作为本发明的第3方式，本发明人等提供使用了上述规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸的心肌细胞的增殖方法。更具体而言，这样的心肌细胞的增殖方法包括以下的方式(3-1)—种心肌细胞的增殖方法，其特征在于，将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入心肌细胞内并使其表达。(3-2)根据上述(3-1)所述的方法，其中，miRNA为选自由成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(3-3)根据上述(3-1)或(3-2)所述的方法，其中，miRNA为包含由SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质。(3-4)根据上述(3-3)所述的方法，其中，包含由SEQ ID NO: I构成的种子序列的物质为选自由 miR-148a (SEQ ID NO:3)、miR_148b (SEQ ID NO:5),miR-152 (SEQ ID NO:7)及它们的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的物质。(3-5)根据上述(3-3)所述的方法，其中，包含由SEQ ID N0:2构成的种子序列的物质为选自由miR-373 (SEQ ID N0:9)及其前体、以及其突变体及类似物所组成组中的物质。(3-6)根据上述(3-1) (3-5)中任一项所述的方法，其包括利用表达载体或脂质体将规定具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的核酸导入心肌细胞内。(3-7)根据上述(3-6)所述的方法,其中,载体为病毒载体或非病毒性表达载体。(3-8)根据上述(3-7)所述的方法，其中，病毒载体为选自腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、反转录病毒载体、日本血球凝集病毒(HVJ ;别名，仙台病毒)载体、慢病毒载体、牛痘病毒载体、鸡痘病毒载体、乳多空病毒载体中的病毒载体。(3-9)根据上述(3-1) (3-8)中任一项所述的方法，其中，miRNA为含有至少一个修饰核苷间键、至少一个修饰糖部分、至少一个修饰碱基、或它们的组合的miRNA衍生物。发明的效果通过使用本发明的miRNA，从而可提供心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物。若使用本发明的心肌细胞的增殖方法，则能够比以往方法更有效地诱导心肌细胞的细胞分裂、使细胞增殖，由该方法制作的心肌细胞可用作各种药剂的筛选用及移植治疗用的细胞。另外，通过将该方法应用于基因治疗，从而可获得由心肌细胞的坏死、缺失等引起的心脏病的再生医疗的治疗的可能性。可知，本发明的miRNA对心肌细胞显示显著的增殖活性。图 I 为显示实施例 2 中转染 miR-148a (SEQ ID NO: 3),miR-152 (SEQ ID NO: 7)、miR-373 (SEQ ID NO:9)而得的原代培养心肌细胞中的Ki67阳性心肌细胞率的图。Ki67为细胞核蛋白质，是作为用于检测增殖细胞的标志而使用的蛋白质。图2 为显示实施例 3 中感染了表达 miR-148a (SEQ ID NO: 3)、miR-152 (SEQ IDNO:7), miR-373 (SEQ ID NO:9)的重组腺病毒的原代培养心肌细胞中的Ki67阳性心肌细胞率。None表示未处理。图 3-1 为显示实施例 4 中转染 miR-148a(SEQ ID NO: 3)、miR_152(SEQ ID NO: 7)、miR-373 (SEQ ID N0:9)而得的原代培养心肌细胞中的磷酸化组蛋白H3 (H3P)阳性心肌细胞率的图。 图3-2 为显示实施例 4 中感染了表达 miR-148a (SEQ ID NO: 3),miR-152 (SEQ IDN0:7)、miR-373 (SEQ ID NO:9)的重组腺病毒的原代培养心肌细胞中的H3P阳性心肌细胞率的图。None表不未处理。图3-3为实施例4中利用抗H3P抗体、抗肌钙蛋白T抗体、以及用DAPI，对感染了表达 miR-148a (SEQ ID NO: 3)、miR-152 (SEQ ID NO: 7)、miR-373 (SEQ ID N0:9)的重组腺病毒的原代培养心肌细胞进行免疫染色的细胞显微镜照片。H3P:绿、肌钙蛋白T:红、DAPI:蓝图 4 为显示实施例 5 中使表达 miR-148a(SEQ ID NO: 3)、miR_152(SEQ ID NO: 7)、miR-373 (SEQ ID N0:9)的重组腺病毒在生物体内感染大鼠心脏而得到的心脏组织切片的Ki67阳性心肌细胞率的图。


微小RNA (miRNA)本发明提供具有心肌细胞的增殖促进作用的微小RNA (miRNA)。作为本发明的miRNA，只要能够促进心肌细胞的增殖，则什么样的miRNA都可以，可用于使上述心肌细胞增殖。本发明中，miRNA是指包括哺乳类在内的真核生物中大量表达的不编码蛋白质的小RNA，认为其参与发生、分化、增殖等各种生命现象。作为本发明中可使用的miRNA，包括成熟型miRNA及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物。本发明的miRNA可以为单链，也可以为双链。本发明中，成熟型miRNA是指完全加工后的miRNA，为15至30个核苷酸的长度(多为21至25个核苷酸的长度)。成熟型miRNA可构成miRNA家族，所述miRNA家族由共有成熟型miRNA分子的5’侧的I至12的核苷酸中的至少6个连续的核苷酸(该核苷酸部分也称作“种子区域” (Brennecke et al. , PLoS Biology, 3: e 85, (2005))的一组 miRNA 构成。因此，miRNA家族中包含成熟型miRNA的5’区域相同但3’侧不同的多个成熟型miRNA。只要属于相同的miRNA家族，则即使3’侧区域的核酸序列不同，也具有同样的机能，例如报道了关于Bagpipe 3，UTR中的I处8_mer的种子区域的序列(种子序列)(Brennecke etal. , PLoS Biology, 3:e 85, (2005)),在该事例的情况下,构成如下miRNA家族的miRNA中，2个不同的miRNA虽然3’侧不同,但均可抑制含有8_mer祀的报告基因的表达,所述miRNA家族在5’区域中共有与前述I处8-mer种子区域的序列所结合的序列互补的序列。miRNA的前体是指成熟型miRNA的前体RNA。在制备成熟型miRNA的过程中，在活细胞内，就miRNA而言，基因组DNA上存在的miRNA基因首先被转录为数百 数千个碱基左右的miRNA初级转录产物(pri-miRNA),该产物在核内由被称作Drosha的RNase III酶加工，变成约70个碱基左右的具有发卡结构的前体miRNA (pre-miRNA)0因此，本发明中，称作miRNA的前体时,包括miRNA初级转录产物(pri-miRNA)及前体miRNA (pre-miRNA) miRNA突变体是指与生物体原本具有的成熟型miRNA或成熟型miRNA的前体相比，I个或数个核苷酸缺失、置换、插入或添加而成的miRNA。这里，数个是指例如最多7 6个，优选最多5 4个，进一步优选最多3 I个。如上所述，构成miRNA家族的成熟型miRNA分子的5’侧存在“种子区域”，只要属于同一 miRNA家族，则即使3’侧区域的核酸序列不同，也具有同样的机能。因此，miRNA突变体优选为在成熟型miRNA的种子区域以外的部分缺失、置换、插入或添加核苷酸而成的miRNA。
miRNA类似物是指模仿内源性的成熟型miRNA或成熟型miRNA的前体而合成的miRNA。该物质已有市售，可以(例如从Ambion公司)容易地获得。为了提高本发明的miRNA的稳定性，例如，可使用核酸衍生物和/或具有改进型核苷间键的核酸。这些核酸衍生物可以适当选择公知的物质使用。具体而言，例如可列举出甲基膦酸酯(methyIphosphonate)>硫代磷酸酯(phosphorothioate)、二硫代磷酸酉旨(phosphorodithioate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、磷酸三酯(phosphotriester)、讽(sulfone)、娃氧烧(siloxane)、碳酸酯(carbonate)、羧甲基酯(carboxymethylester)、乙酸亚胺(acetamidate)、氨基甲酸酯(carbamate)、硫醚(thioether)、交联型氨基憐酸酯(bridged phosphoramidate)、交联型亚甲基憐酸酯(bridged methylene phosphonate)、交联型硫代憐酸酯(bridged phosphorothioate)>二甲基硫醚(dimethylene-sulfide)、二甲基亚讽(dimethylene-sulfoxide)、二甲基砜(dimethylene-sulfone)、2’ _0_ 烧基(2，-0-alkyl)、及 2’ -脱氧 _2’ -氟代硫代磷酸酯(2，-deoxy-2’ -f luoro phosphorothioate)等含有核苷间键的核酸等(Uhlmann& Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584, (1990), Schneider et al., TetrahedronLetters, 31:335-338, (1990))。进而可列举出 Locked Nucleic Acid (Koshkin et al., Journal of the American Chemical Society,120:13252-13253(1998))、ENA(US7335765)等衍生物。本发明中将这样的核酸衍生物和/或具有改进型核苷间键的miRNA称作miRNA衍生物。miRNA衍生物包括成熟型miRNA的衍生物、miRNA的前体的衍生物、miRNA突变体的衍生物、及miRNA类似物的衍生物。本发明中可使用的miRNA例如可通过使用公知的方法从天然物中分离、化学合成、或利用基因重组技术产生从而获取，此外，还可以以市售品的方式获得。例如，成熟型miRNA已经注册为Sanger miRbase,该注册过的全部miRNA可以从Ambion公司、Qiagen公司、Sigma公司、Thermo Scientific公司等获得。作为用于将miRNA送达至生物体内的细胞或体外细胞的细胞内的方法，可以使用表达载体或脂质体等该技术领域中通常使用的基因送达方法的任一种。上述成熟型miRNA或miRNA的前体也可以以低聚核酸或衍生物的形式使用，但从其表达效率、效果持续时间等方面来看，优选以重组至表达载体的形式使用。使用表达载体作为基因送达方法时，只要是具有可表达miRNA的启动子的表达载体，则可以为任意，可以使用病毒性表达载体或非病毒性表达载体。作为病毒性表达载体，可例示出腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、反转录病毒、日本血球凝集病毒(HVJ ;别名，仙台病毒)、慢病毒、牛痘病毒、鸡痘病毒、以SV40为代表的乳多空病毒等来源的载体，优选通过使用腺病毒载体、AAV载体、HVJ载体、或慢病毒载体，进行有效的基因导入以及导入的基因的高水平表达。利用这些病毒载体进行的基因的导入是向哺乳动物的细胞中导入基因的最强大的方法之一，事实上，可用于向所有种类的人细胞及多数非人细胞中导入。另外，由于这些病毒的感染不依赖于细胞周期，因此能够在各种原代培养细胞系及转化细胞系内使基因表达。特别是即使在心肌细胞这样的不发生DNA合成、细胞分裂的细胞内也能够效率良好地导入基因。感染后多数细胞接受数个重组DNA (或RNA)拷贝，因此导入的基因暂时进行高水平表达。
在利用腺病毒载体、HVJ载体等时，通常，DNA/RNA留在细胞质内，并不进入核内。因此，使用这些病毒载体时，存在如下优点外来基因重组至宿主细胞基因组内时，几乎不发生随机发生的诱导突变的错误。作为本发明的优选方式之一使用的腺病毒载体可通过如下方法调制以人胎儿肾脏293细胞或大肠菌作为宿主使用同源重组的方法(Miyake etal., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica，93:1320-1324，(1996))，或利用简单的体外连接的方法(Mizuguchi & Kay，HumanGene Therapy，9:2577-2583，(1998))。腺病毒为具有双链DNA基因组的DNA病毒之一，研究最多的是人的腺病毒5型和2型。通过使这些野生型腺病毒的El和E3基因的大部分缺失，从而能够制作 不具有复制能力的病毒载体，能够插入数kb的外来DNA而不对病毒颗粒形成带来有害作用。该重组腺病毒虽然欠缺转录调节因子El基因，但通过插入的基因特异性转录单元，能够仅使插入的目的基因表达，而不依赖于靶细胞的增殖、或其他病毒基因的有无。腺伴随病毒(AAV)为属于细小病毒科的约4. 7kb的单链DNA病毒，已知I型至12型的血清型的AAV。AAV载体通过将插入两端的ITR (Inverted terminal repeat,末端反向重复序列)的R印(参与复制或插入)和Cap (病毒壳体)置换为目的基因从而制作。将该载体与表达R印、Cap的质粒一起导入293细胞，进而以腺病毒作为辅助病毒使其感染，调制蓄积于核内的重组腺伴随病毒载体。最近还开发了一种通过向表达E1A、E1B的293细胞中导入表达E2A、E4、VA的质粒而不需要辅助病毒的方法。仙台病毒(Sendai virus ;SeV)为属于副粘病毒属的啮齿类的病毒,别名也称作日本血球凝集病毒(Hemagglutinating Virus of Japan ;HVJ)。SeV的基因组由单股负链RNA(与mRNA互补)构成，编码核蛋白(NP)、核蛋白磷酸化酶(P)、病毒表面支架蛋白(M)、红血球凝集蛋白(HN)、膜融合蛋白(F)、及RNA合成酶(L)的6个基因。SeV通过血凝神经氨酸苷酶HN (hemaglutination-neuraminidase)蛋白吸附/分解宿主细胞的唾液酸从而结合,将基因组注入细胞质内。迁移至细胞内的病毒基因组通过自编码的L蛋白的作用进行基因的转录/复制。与通常的病毒不同，该步骤在细胞质内进行，病毒基因组不迁移至核内。就SeV载体而言，通过使一个或数个对于导入细胞内的载体的自主复制而言所必须的N、P、L基因以外的F、HN、M基因缺损，从而可制作成非传播性载体。F基因缺失型载体如下而制作使用在由噬菌体T7来源的RNA聚合酶识别的T7启动子下游插入重组载体cDNA而得的质粒、T7启动子支配下的N、P、F、L表达质粒、进而T7RNA聚合酶表达重组牛痘病毒，导入至猴子肾来源的LLC-MK2细胞，最近，仅基于6种质粒(在T7启动子下游插入重组载体cDNA而得到的质粒和CAG启动子支配下的N、P、L、F、T7RNA聚合酶基因表达质粒)的转染的简便的制作方法也变得可能。关于腺病毒载体及其他病毒载体的概论、以及制作方法、使用方法，本领域技术人员可以参考多种参考书籍。例如，可列举出Gene Therapy Protocols: Methodsin Molecular Medicine (Robbins 编，Humana Press,1997), Gene Transfer inCardiovascular System:Experimental Approaches & Therapeutic ImplicationsCMarch编，Kluwer Academic Publishers, 1997),Adenoviral Vectors for Gene TherapyCCuriel& Douglas编，Academic Press, 2002)等。另外,用于制作腺病毒载体的试剂盒已有市售，可以容易地(从Invitrogen公司的ViraPower 腺病毒表达系统(#K4930)、Takara Bio公司的Adenovirus Expres sion Vector Kit (#6170)等)获得，可利用于本发明的实施中。另外，用于制作AAV载体、SeV载体的试剂盒也已有市售(AAV Helper-Free系统(Stratagene公司；#240071)、重组仙台病毒迷你载体调制试剂盒(MBL公司；DV_0001)等)可容易地获得，可用于本发明的实施中。作为非病毒性表达载体，例如，可列举出具有如下启动子的载体SV (Simianvirus) 40病毒启动子、巨细胞病毒(Cytomegaro virus ；CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子等病毒来源的启动子、β_肌动蛋白启动子、EF(elongation factor) I α启动子等、向鸟β -肌动蛋白启动子中重组CMV的增强子及兔子球蛋白基因的聚A附加信号序列而得的嵌合启动子CAG启动子(Niwa etal.，Gene, 108:193-199，(1991))、及作为Pol. III启动子的U6或Hl启动子等，但不限于这些载体。可利用这些启动子的表达载体已有市售，可容易地(从Ambion公司、Invitrogen公司、TAKARA BIO公司等)获得。
作为导入上述基因或基因载体的方法，可以使用所有公知的方法，例如使用了磷酸钙、电脉冲的转染法；向脂质体等中封入目的基因然后转染至细胞的方法；以及向反转录病毒、腺病毒等病毒载体中重组目的基因，使该重组病毒感染细胞的方法等。此时，病毒载体是指，向病毒DNA或RNA的全长或使一部分缺损·变异而得到的核酸序列中重组目的基因并能够进行表达的构建物。作为脂质体的具体例，可以使用包括三甲基[2，3_( 二油烯基氧基)丙基]氯化铵(D0TMA)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)等在内的脂质制剂。具体的miRNA的获取本发明人等基于在导入心肌细胞时是否显示显著的BrdU的引入能力，对成熟型miRNA 文库进行检索，发现了 miR-148a (SEQ ID NO: 3)、miR_148b (SEQ ID NO: 5)、miR_152(SEQ ID N0:7)、&miR-373 (SEQ ID NO:9)等作为具有心肌细胞的增殖促进作用的成熟型miRNA，将它们用于进一步的实验。作为本发明中可使用的优选的miRNA，还包括这些成熟型miRNA的前体。例如，作为成熟型miRNA的前体，作为例子可列举出各miRNA的miRNA初级转录产物(pri-miRNA)或前体miRNA(pre-miRNA)等。作为其具体例，例如，作为编码前述具体的成熟型miRNA的基因的初级转录产物(pri-miRNA)的以下的物质也包括在本发明中可使用的优选的miRNA内mir-148a (miR_148a 的前体，SEQ ID N0:4)、mir_148b (miR_148b 的前体，SEQ ID N0:6)、mir-152 (miR-152 的前体，SEQ ID 勵:8)以及砧1-373 (miR-373 的前体，SEQ ID N0:10)。[表 I]


本发明的课题在于提供使用了促进心肌细胞的增殖的miRNA的心肌细胞的增殖方法、心脏病治疗用载体及心脏病治疗用药物组合物等。提供使用了具有心肌细胞的增殖促进作用的miRNA的心肌细胞的增殖方法、含有该miRNA的心脏病治疗用载体及含有该载体的心脏病治疗用药物组合物等。作为miRNA，特别优选选自由作为成熟型miRNA的miR-148a、miR-148b、miR-152及miR-373以及该miRNA的前体、以及它们的突变体及类似物所组成组中的miRNA。