专利名称：一种载抗肿瘤小分子干扰rna磁性纳米探针的制备方法抗肿瘤小分子干扰RNA(简称siRNA)是一种具有21 25核苷酸序列的小RNA分 子，由Dicer (RNAase III家族中对双链RNA具有特异性的酶)的ATP依赖性RNA酶切割双 链RNA所形成。siRNA形成之后，与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体，此 复合体通过碱基互补配对识别靶mRNA并使其降解，从而导致特定基因沉默。癌症的发生可以看作是一种基因的疾病，即某些原癌基因被一些特殊的内源或外 源性的因子所激活，从而引起的细胞的各种形态学和生理生化的转变，进行非机体控制的 持续分裂增殖，最终耗竭机体导致死亡。癌症的基因治疗是继手术、化疗、放疗后的新型治 疗手段，它利用基因转移技术将正常或野生型等外源基因导入宿主细胞，直接修复或纠正 肿瘤相关基因的结构与功能缺陷，或者阻断癌症基因的表达，从而诱导肿瘤细胞凋亡。肿瘤靶向治疗是针对导致细胞恶性转化的环节，使用某些能与这些靶分子特异结 合的抗体、配体等，定向引导治疗药物至肿瘤靶部位，从而在分子水平逆转该恶性生物学行 为，抑制肿瘤细胞生长。目前已有贝伐单抗、曲妥单抗、阿仑单抗、西妥昔单抗、托西莫单抗 等多种抗体被美国食品和药物管理局(FDA)批准应用于靶向抗肿瘤治疗。分子影像学是利用现有的一些医学影像技术对人体内部生理或病理过程在分子 水平上进行无损伤的、实时的成像，是将分子生物学技术和现代医学影像学相结合的产物。 其中核磁共振成像具有极高的空间分辨力和组织分辨力，是分子影像学中的重要研究手 段。核磁共振分子成像能够对肿瘤进行早期及特异性的诊断，并能监测抗肿瘤治疗的效果。 构建具有肿瘤的分子成像与治疗共同作用的靶向纳米分子探针是癌症诊断与基因治疗领 域的研究热点。
本发明提供了一种载抗肿瘤SiRNA磁性纳米探针的制备方法。用于靶向传递抗肿 瘤siRNA至目标靶点，实现肿瘤的基因治疗，并同时携带超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒，可 利用核磁共振成像技术特异性诊断和实时监测肿瘤治疗效果。本发明的磁性纳米探针是这样实现的首先将水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗 粒和siRNA通过静电作用相互结合形成复合物，然后采用复乳化法将复合物包载于羧基封 端的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物(简称PLGA-C00H)中制备纳米粒，再通过碳二亚胺法 连接上单克隆抗体，最终获得载抗肿瘤siRNA的磁性纳米探针。具体包括以下步骤(1)将抗肿瘤小分子干扰RNA溶于DEPC水中，加入乙酰化小牛血清白蛋白或低分 子量肝素钠混勻，加入水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒中，4°C冰箱孵育lh，形成水相 复合物；3(2)将羧基封端的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物溶于二氯甲烷中，加入上述水相复 合物，形成初乳后溶于聚乙烯醇的DEPC水溶液中，挥去有机溶剂，离心，超滤，水洗3 5次 得到纳米粒溶液；(3)将上述纳米粒溶液浓缩，加入pH = 5的2-吗啉乙磺酸溶液活化，超滤，溶于 PH = 7. 4的PBS缓冲液中，加入N-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳酰 二亚胺盐酸盐，孵育池，加入单克隆抗体，4°C冰箱孵育过夜，脱盐柱纯化，得载抗肿瘤小分 子干扰RNA的磁性纳米探针。本发明所述DEPC水为焦碳酸二乙酯处理的超纯水，所用器皿经焦碳酸二乙酯处理。本发明所述低分子量肝素钠的平均分子量小于8000道尔顿。本发明所述水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒的粒径小于50nm，磁饱和强度值 为40 lOOemu/g，水溶液中分散后表面电荷呈阳性。本发明所述单克隆抗体为贝伐单克隆抗体、曲妥单克隆抗体、阿仑单克隆抗体、西 妥昔单克隆抗体或托西莫单克隆抗体。本发明所述载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针具有抑制肿瘤细胞生长的作用。本发明所述载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针可以作为造影剂，应用于实时 监测肿瘤病变和治疗中的变化情况。本发明与现有技术相比，具有如下有益效果1.采用带正电荷的水溶性超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒与带负电荷的乙酰化白 蛋白或低分子量肝素钠稀释的抗肿瘤siRNA通过静电吸引方式结合，形成的复合物稳定性 好；2.采用羧基封端修饰的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物作为高分子基包载物，使得 所制备的纳米粒表面具有可化学键接的活性位点；3.采用碳二亚胺法在纳米粒表面连接单克隆抗体，使整个纳米探针具有较高的特 异性识别作用；4.通过本发明制备的纳米探针既可传递抗肿瘤siRNA用做肿瘤基因治疗，又可同 时携带超顺磁性纳米粒子进入肿瘤部位，方便肿瘤的分子影像诊断与实时检测肿瘤治疗效图1为本发明实施例3在作用4 后，利用MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结

实施例4对本发明制备的磁性纳米探针进行抗肿瘤药效学试验肺癌细胞系似49、肝癌细胞系H印G2和胃癌细胞系SGC7901在含15%胎牛血清 (Fetal Bovine Serum，简称FBS)的DMEM完全培养基(GIBC0公司，美国)培养，培养条件 为37°C，5% CO2培养箱中湿润培养。将4. 0 X IO4ceIVcm2细胞接种于96孔板，孵育24h使细 胞贴壁后，设立空白对照组、载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针处理组和阴性对照组， 每组平行设3个复孔。孵育44h后弃去上清培养液，每孔加入20 μ L新配制的5g/L 3-(4, 5-二甲基噻唑-2) -2，5- 二苯基四氮唑溴盐(简称MTT)，孵育4h，移去上清液，加入150 μ L 二甲基亚砜溶解，混勻后用酶标仪在490nm波长处测定吸光度，计算肿瘤细胞抑制率。图1为作用4 后MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率结果。结果显示，经过本发 明载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针作用后的肺癌细胞系AM9、肝癌细胞系HepG2和 胃癌细胞系SGC7901的分裂明显减少，细胞生长受到明显抑制，载抗肿瘤小分子干扰RNA磁 性纳米探针在0 60 μ M对肿瘤细胞系的抑制作用逐渐增强。


本发明公开了一种载抗肿瘤小分子干扰RNA磁性纳米探针的制备方法，包括以下步骤将超顺磁性四氧化三铁纳米颗粒和抗肿瘤小分子干扰RNA通过静电作用相互结合形成复合物，采用复乳法将复合物包载于羧基封端的聚(乳酸-羟基乙酸)共聚物中制备纳米粒，通过碳二亚胺法连接上单克隆抗体获得磁性纳米探针。本发明制备的磁性纳米探针可以通过单克隆抗体的特异性介导纳米粒进入细胞，所载抗肿瘤小分子干扰RNA具有较高的转染效率，可阻断基因活性，抑制肿瘤细胞分裂，诱导肿瘤细胞凋亡，具有抗肿瘤作用。同时纳米探针所载的超顺磁性纳米颗粒可作为核磁共振成像技术的造影剂，实时监测肿瘤病变和治疗中的变化情况。