专利名称：一种从大豆或豆粕中纯化制备抗肿瘤因子－组织蛋白酶b抑制因子的方法 蛋白酶是指水解蛋白质的酶，是维持人体正常生理功能的关键分子。根据水解蛋白质的部位不同，可以将蛋白酶分为外肽酶和内肽酶，外肽酶从蛋白质的羧基端或氨基端水解蛋白质，内肽酶从蛋白质的中间水解蛋白质。内肽酶又根据活性中心的氨基酸残基分为半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，其中，半胱氨酸蛋白酶又包括数十种不同的蛋白酶。在正常生理代谢中，蛋白酶主要参与食物和体内蛋白质的水解，如胃蛋白酶和肠道中的胰蛋白酶水解食物蛋白为人体提供氨基酸；溶酶体蛋白酶参与细胞内非必需的蛋白质水解，使氨基酸得以循环利用；蛋白酶还参与酶原活化，保持体内必需的蛋白水解平衡，如纤溶酶原激活因子tPA使纤溶酶原活化成纤溶酶，水解纤维蛋白，防止或治疗血栓引起的心脑血管疾病。但在疾病状态下，蛋白酶会异常表达，导致蛋白水解异常，最典型的例子是急性胰腺炎时，胰腺破裂，胰液及其中的胰蛋白酶外流，水解正常组织，成为继心肌梗死和脑血管意外后的第三大高致死性急病。另一个典型例子是肿瘤，目前已经证明肿瘤的发生和恶化是由于某些蛋白酶异常高表达引起的。大多数肿瘤死亡并不是由于原发肿瘤死亡，而是由于肿瘤转移到身体的其它部位引起的死亡。恶性肿瘤细胞具有如下特征，可以从原发肿瘤细胞脱落并转移到邻近组织、血管和淋巴，可以进入血管作远距离迁移，然后再出血管，迁移到周围组织并形成新的肿瘤，形成新的血管以支持肿瘤生长和转移。正常细胞是由细胞间基质蛋白包括弹性蛋白和胶原蛋白形成的复合网络固定在组织内的，这些基质蛋白在组织重建、受伤康复和胚胎发育中被水解，癌细胞在从原发部位转移时也必须水解这些蛋白质，一系列蛋白酶参与了这个过程，包括尿激酶-血纤溶酶原激活因子、半胱氨酸蛋白酶中的组织蛋白酶B和组织蛋白酶L、金属蛋白酶中的胶原酶等。其中，组织蛋白酶B的高表达被认为是导致某些肿瘤发生和恶化转移的重要因素，例如乳腺癌，膀胱癌。研究认为组织蛋白酶B的含量可以作为癌症病人的预后指标。研究发现，组织蛋白酶B是某些肿瘤细胞转移的最关键的第一步-即水解细胞间基质的关键酶。组织蛋白酶B属于半胱氨酸蛋白酶，在正常情况下位于溶酶体内，参与胞内蛋白质水解，为机体提供可循环使用的氨基酸。在肿瘤细胞中，组织蛋白酶B高表达，迁移到细胞表面和释放到胞外，水解细胞间基质，启动肿瘤细胞迁移。有研究表明，用组织蛋白酶B的抗体或组织蛋白酶B的抑制因子可以抑制肿瘤细胞的迁移。许多药物都是酶抑制因子，这些抑制因子可以分为竞争性抑制和非竞争性抑制因子，竞争性抑制因子直接占据酶活性中心，非竞争性抑制因子结合于酶的其它部位但会影响酶的催化活性。用蛋白酶抑制因子治疗疾病最著名的例子是艾滋病治疗。艾滋病毒需要将蛋白质前体剪切成有功能的各种蛋白质，参与病毒的复制，剪切蛋白质前体的是一种天冬氨酸蛋白酶，可以特异性地水解苯丙氨酸-酪氨酸或苯丙氨酸-脯氨酸之间的肽键，这是目前已知的人类蛋白酶所不能水解的肽键。当人们发明了该蛋白酶的抑制因子后，使艾滋病病人的死亡率降低了70％，成为艾滋病防治的最大新闻，使艾滋病治疗有了希望。蛋白酶抑制因子包括化合物和肽类抑制因子，生物体内的蛋白酶抑制因子(Proteinase Inhibitor，PI)是对蛋白酶有抑制活性的一类小分子蛋白质，属于肽类抑制因子，普遍存在于动植物体内，它们能与蛋白酶的活性部位和变构部位结合，抑制酶的催化活性或阻止酶原转化为有活性的酶。动物体内的蛋白酶抑制因子的功能是调节体内蛋白酶活性，从而控制体内蛋白水解平衡。许多农作物如大豆、小麦、玉米、番茄和马铃薯中都有高含量的蛋白酶抑制因子，一般储存于种子和块茎内，在某些植物的贮藏器官中，其含量占总蛋白的10％，是植物抵御害虫啮食和病原体侵染的主要分子。另外，植物叶片受到机械损伤或经化学物质处理后，也会产生大量蛋白酶抑制因子。目前已知的植物蛋白酶抑制因子可以分为十大类，许多具有抗癌功能的蔬菜和水果如谷物、马铃薯、南瓜等都含有蛋白酶抑制因子，与它们的抗癌功能有一定的关系。大豆中已经报道的蛋白酶抑制因子属于丝氨酸蛋白酶抑制因子。大豆(Glycine max)中的蛋白酶抑制因子主要存在于种子的子叶中，尤以子叶外侧含量丰富，约占总蛋白的6％。大豆中的Kunitz胰蛋白酶抑制因子KTI，分子量为21,000道尔顿，由181个氨基酸残基组成，含2个二硫键，活性中心在第63个氨基酸(精氨酸)和第64个氨基酸(异亮氨酸)之间。Kunitz胰蛋白酶抑制因子主要抑制胰蛋白酶，对糜蛋白酶只有微弱的抑制作用。该抑制因子的活性中心和胰蛋白酶结合非常紧密，形成不可逆复合物。大豆的Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子BBI，分子量为8,000道尔顿，由71个氨基酸残基组成，含有7个二硫键，有2个不同的活性中心即第16个氨基酸(赖氨酸)和第17个氨基酸(丝氨酸)残基之间及第43个氨基酸(亮氨酸)和第44个氨基酸(丝氨酸)残基之间，分别与胰蛋白酶和糜蛋白酶结合。目前经检索，未见从大豆中纯化组织蛋白酶B抑制因子的研究报道，也没有从大豆或豆粕中直接纯化组织蛋白酶B抑制因子的技术的报道。
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种从大豆或豆粕中纯化制备抗肿瘤因子-组织蛋白酶B抑制因子的方法。利用本发明的方法可以纯化得到了一种分子量为10kDa的组织蛋白酶B抑制因子。本发明涉及的从大豆或豆粕中纯化制备抗肿瘤因子-组织蛋白酶B抑制因子的方法，包括如下步骤(1)取大豆或豆粕研磨成粉，使其颗粒直径为10μm～50μm，(2)溶入缓冲液中搅拌15小时～24小时，过滤去除沉淀，上清液经8,000rpm～14,000rpm离心8min～15min，50％硫酸铵沉淀，(3)将上述沉淀溶解在刚浸没量的缓冲液中，于10倍体积的缓冲液中透析18小时～24小时，(4)透析后的溶液经8,000rpm～14,000rpm离心8min～15min，
(5)将步骤(4)的上清液缓慢加到用缓冲液平衡过的排阻层析柱上，用缓冲液分离并分部收集其中有抑制活性的部分，(6)将所述收集液缓慢加到用缓冲液平衡过的离子交换柱上，先用200ml缓冲液洗涤柱子以去除未结合的蛋白质，再用100ml缓冲液对100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脱，分部收集，得到组织蛋白酶B抑制因子。
其中，所述豆粕是指提取大豆油后的残渣。
其中，所述缓冲液优选是10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl缓冲液或20mmol/L、pH7.5的磷酸缓冲液。
其中，步骤(2)或(4)所述离心条件优选是10,000rpm离心10min。
其中，步骤(5)所述排阻层析柱优选是Sephadex G-75或Superdex排阻层析柱。
其中，步骤(6)所述离子交换柱优选是DEAE-Toyopearl或CM-Sepharose离子交换柱。
其中，步骤(4)透析后的溶液还可以先经蛋白酶或无机酸水解处理后，再进行下续步骤。
其中，上述的无机酸优选是盐酸。
其中，所述步骤(5)或(6)的顺序可以前后交换。
其中，依据步骤(1)至(6)的方法还可以得到组织蛋白酶L、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶的抑制因子。
利用本发明的方法纯化得到组织蛋白酶B抑制因子，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分子量为10kDa，从100克大豆或豆粕中可以纯化到5mg～10mg组织蛋白酶B抑制因子。用蛋白酶或无机酸水解后的纯化产物分子量小于10kDa。
下面结合实验，对利用本发明的方法纯化得到组织蛋白酶B抑制因子的药理作用作进一步的说明。
组织蛋白酶B抑制因子的活性检测方法方法(1)取50μl待检测的抑制因子样品，加入10U组织蛋白酶B，加6μl乙酸buffer(0.1mol/L，pH3.6)调节pH成酸性，37℃温育15min，加入200μl 1％牛血红蛋白(0.1mol/L乙酸buffer，pH3.6)做底物，37℃温育1h，加入0.5ml 5％TCA终止反应，10,000rpm离心10min，取200μl上清液加入250μl 1mol/L NaOH，加2ml C液(2％NaCO30.5％酒石酸钠鉀0.5％无水硫酸铜50∶0.5∶0.5)， 加200μl福林酚，混匀后静置10分钟，检测750nm光吸收值。对照同样处理，但用等量的Tris-HCl缓冲液替代抑制因子样品(Zhao et al，2002)。
方法(2)用合成的荧光底物Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC检测抑制因子对组织蛋白酶B活性的影响。100μl醋酸钠缓冲液(100mM，pH4.5或其它适合的pH含0.05％Brij-35，1mM EDTA and 1mM cysteine)，加入Z-Arg-Arg-AMC或Z-Phe-Arg-AMC至终浓度为0.1mM/l或其它合适的浓度。将10U组织蛋白酶B与待监测的抑制因子混合，用荧光微孔板测读仪在25度用355nm波长激发光和460nm波长发射光检测，每20秒一次，共30分钟(Bown et al.，2004)。
组织蛋白酶B抑制因子的抗肿瘤活性鉴定人宫颈癌细胞(Hela)和神经胶质瘤细胞(glioma)，用含10％新生牛血清，pH7.0的DMEM培养液在37℃，5％CO2及饱和湿度的培养箱内培养。抑制因子用Tris-HCl缓冲液调整为0.25mg/ml，0.5mg/ml和1mg/ml三种浓度，无菌抽滤，每种细胞设置5个处理空白对照(为培养基和用等体积Tris-HCl缓冲液替代抑制因子)、正常细胞对照(用等体积Tris-HCl缓冲液替代抑制因子)、0.025mg/ml，0.05mg/ml和1mg/ml抑制因子，每种处理设6个重复。将贴壁生长的Hela细胞和神经胶质瘤细胞分别用0.25％胰蛋白酶消化至细胞收缩、细胞间出现空隙时，吸弃培养液，并用含血清的DMEM培养液终止消化，同时用吸管吹打使细胞悬起成单细胞悬液，调整细胞人宫颈癌细胞(Hela)和神经胶质瘤细胞(glioma)密度至104个/ml，以每孔100μl的量传代于96孔板，次日，细胞生长至指数生长期，吸弃上清液，空白对照组、细胞对照组换10μl buffer A+90μl DMEM培养液，实验组各孔先加90μl DMEM培养液，再分别加不同浓度抑制因子10μl，混匀，继续培养24h后，各孔中加入5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)20μl，然后再培养4小时，弃去上清液，每孔加100μl DMSO，10分钟后紫色沉淀溶解，用酶联仪测定570nm波长下吸光度值，并以下式计算存活细胞百分数存活细胞百分率＝A实验/A对照×100％。抑制试验数据经统计分析，结果显示大豆组织蛋白酶B抑制因子在0.025～0.1mg/ml终浓度时，对人宫颈癌细胞(Hela)和神经胶质瘤细胞(glioma)生长的抑制率分别达到6～25％和5～20％。
上述实验证明大豆组织蛋白酶B抑制因子对人宫颈癌细胞(Hela)和神经胶质瘤细胞(glioma)生长有显著抑制效果。因此，该抑制因子有可能进一步研究开发成为抗肿瘤药物或肿瘤预防药物或相关保健预防食品的可能。本发明的技术方法适合放大生产，利用大豆或制取大豆油后的副产品豆粕均可纯化制备该抑制因子，为大豆产品精加工和原料的综合利用提供了新的途径。

实施例1取大豆或豆粕研磨成粉，溶入Tris-HCl缓冲液中(10mmol/L Tris-HCl pH7.5，或其它相同功能等缓冲液)中搅拌过夜，过滤去除沉淀，上清液经10,000rpm离心10min，50％硫酸铵沉淀，沉淀溶解在少量Tris-HCl缓冲液中，于10倍体积的Tris-HCl缓冲液中透析过夜。透析后的溶液经10,000rpm离心10min，将上清液缓慢加到用Tris-HCl缓冲液平衡过的排阻层析柱上(Sephadex G-75，或其它功能相同的层析柱)用Tris-HCl缓冲液分离并分部收集其中有抑制活性的部分。将收集液缓慢加到用Tris-HCl缓冲液平衡过的离子交换柱上(如DEAE-Toyopearl、CM-Sepharose柱或其它功能相同的层析柱)，先用200ml Tris-HCl缓冲液洗涤柱子以去除未结合的蛋白质，再用100ml Tris-HCl缓冲液对100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脱，分部收集。用此技术获得的产物，按前述活性检测方法，检测收集有组织蛋白酶B抑制活性的部分，SDS-PAGE检测分子量为10kDa左右，对肿瘤细胞生长有显著抑制作用，可以进一步开发成肿瘤治疗药物或肿瘤预防药物。
实施例2将实施例1中的缓冲液换成pH7.5的磷酸缓冲液(或其它合适的缓冲液)，从大豆或豆粕中纯化组织蛋白酶B抑制因子及获得的产物。详细技术取大豆或豆粕研磨成粉，溶入磷酸缓冲液中(20mmol/L pH7.5)，搅拌过夜，过滤去除沉淀，上清液经12,000rpm离心8min，50％硫酸铵沉淀，沉淀溶解在刚浸没量的磷酸缓冲液中，于10倍体积的磷酸缓冲液中透析22小时。透析后的溶液经10,000rpm离心13min，将上清液缓慢加到用磷酸缓冲液平衡过的排阻层析柱上(Sephadex G-75)，用磷酸缓冲液分离并分部收集其中有抑制活性的部分。再将收集液缓慢加到磷酸缓冲液平衡过的离子交换柱上(DEAE-Toyopearl)，先用200ml磷酸缓冲液洗涤柱子以去除未结合的蛋白质，再用100ml缓冲液对100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脱，分部收集。用此技术获得的产物，按前述活性检测方法，检测收集有组织蛋白酶B抑制活性的部分，SDS-PAGE检测分子量为10kDa左右，对肿瘤细胞生长有显著抑制作用，可以进一步开发成肿瘤治疗药物。
实施例3将实施例1和2中的层析柱换成其它功能相同的层析柱，从大豆或豆粕中纯化组织蛋白酶B抑制因子及获得的产物。详细技术取大豆或豆粕研磨成粉，溶入Tris-HCl缓冲液中(10mmol/L Tris-HCl pH7.5)，搅拌过夜，过滤去除沉淀，上清液经10,000rpm离心10min，50％硫酸铵沉淀，沉淀溶解在少量Tris-HCl缓冲液中，于10倍体积的Tris-HCl缓冲液中透析过夜。透析后的溶液经10,000rpm离心10min，将上清液缓慢加到用Tris-HCl缓冲液平衡过的排阻层析柱上(Superdex)用Tris-HCl缓冲液分离并分部收集其中有抑制活性的部分。将收集液缓慢加到用Tris-HCl缓冲液平衡过的离子交换柱上(DEAE-Sepharose)，先用200ml Tris-HCl缓冲液洗涤柱子以去除未结合的蛋白质，再用100ml Tris-HCl缓冲液对100ml 0.5mol/L NaCl溶液作梯度洗脱，分部收集。用此技术获得的产物，按前述活性检测方法，检测收集有组织蛋白酶B抑制活性的部分，分子量为10kDa左右，对肿瘤细胞生长有显著抑制作用，可以进一步开发成肿瘤治疗药物。
实施例4在实施例1、2、3的基础上，改变层析柱的顺序，从大豆或豆粕中纯化组织蛋白酶B抑制因子并获得目的产物。取大豆或豆粕研磨成粉，溶入适当的缓冲液中，搅拌过夜，过滤去除沉淀，上清液经离心，硫酸铵沉淀，沉淀溶解在少量缓冲液中，于缓冲液中透析过夜。透析后的溶液经离心，将上清液缓慢加到用缓冲液平衡过的离子交换柱上，先用缓冲液洗涤柱子以去除未结合的蛋白质，再用缓冲液对NaCl溶液作梯度洗脱，分部收集。将收集液浓缩，缓慢加到用缓冲液平衡过的排阻层析柱上，用缓冲液分离并分部收集其中有抑制活性的部分。用此技术获得的产物，按前述活性检测方法，检测收集有组织蛋白酶B抑制活性的部分，分子量为10kDa左右，对肿瘤细胞生长有显著抑制作用，可以进一步开发成肿瘤治疗药物。
实施例5在实施例1、2、3、4的基础上，先用蛋白酶或无机酸水解大豆或豆粕，再纯化组织蛋白酶B抑制因子并获得目的产物。取大豆或豆粕研磨成粉，溶入适当的缓冲液中，搅拌过夜，过滤去除沉淀，上清液经离心，硫酸铵沉淀，沉淀溶解在少量缓冲液中，于缓冲液中透析过夜。透析后的上清液经胰蛋白酶水解或盐酸水解后，加到用缓冲液平衡过的离子交换柱上，先用缓冲液洗涤柱子以去除未结合的蛋白质，再用缓冲液对NaCl溶液作梯度洗脱，分部收集。将收集液浓缩，缓慢加到用缓冲液平衡过的排阻层析柱上，用缓冲液分离并分部收集其中有抑制活性的部分。用此技术获得的产物，按前述活性检测方法，检测收集有组织蛋白酶B抑制活性的部分，分子量为10kDa或小于10kDa，对肿瘤细胞生长有显著抑制作用，可以进一步开发成肿瘤治疗药物。


本发明公开了一种从大豆或豆粕中纯化制备抗肿瘤因子－组织蛋白酶B抑制因子的方法，包括大豆或豆粕研磨、搅拌、沉淀、透析、排阻层析柱、离子交换柱分离、洗脱、分部收集等步骤；利用本发明的方法纯化制备的大豆组织蛋白酶B抑制因子对人宫颈癌细胞(Hela)和神经胶质瘤细胞(glioma)生长有显著抑制效果，为一步研究开发成为抗肿瘤药物或肿瘤预防药物或相关保健预防食品以及大豆产品精加工和原料的综合利用提供了新的途径。