一种抗肿瘤药物制作方法

朱冰, 朱 冰

2004年1月7日

2002年6月28日

2002年6月28日

朱冰, 朱 冰

A61P35/00GK1465396SQ02123448

抗肿瘤 药物

1.一种治疗肿瘤的药物，它的活性成分是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有序列表中序列2的氨基酸残基序列3.根据权利要求1或2所述的一种治疗肿瘤的药物，其特征在于所述药物中还含有人体可接受的药用载体4.一种具有抑瘤作用融合蛋白的编码基因，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述具有抑瘤作用融合蛋白的编码基因是序列表中序列1的DNA序列6.一种具有抑瘤作用的融合蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质7.根据权利要求6所述的蛋白质，其特征在于所述蛋白质具有序列表中序列2的氨基酸残基序列8.权利要求3所述的融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用9.权利要求4所述的融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用

本发明涉及一种抗肿瘤的药物，特别是涉及一种以重组蛋白为活性成分的抗肿瘤药物靶向毒素包括两部分一部分是能够杀伤细胞的毒素，另一部分为能够介导毒素到达目标细胞的标识载体目前，已经构建了许多种用于杀伤癌细胞的靶向毒素，其中包括植物毒素(如篦麻毒素)、细菌毒素(如白喉毒素(DT)、绿脓杆菌外毒素(APE))和真菌毒素等，这些毒素对哺乳动物细胞都有很强的细胞毒性标识载体包括多种蛋白，如转移生长因子(TGF)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素(IL-2、IL-4)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、EGF受体抗体、HER2受体抗体，转铁蛋白等等毒素部分同载体的连接可以通过化学法偶联或者通过基因工程的方法获得融合蛋白有报道表明，基因工程构建的靶向毒素比化学偶联法构建的更有效研究证明，许多癌细胞的EGF受体基因被放大了，并在细胞表面过量表达EGF受体，包括乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠结肠癌、子宫颈癌和脑瘤目前已有数种靶向毒素被构建来杀死过量表达EGF受体的癌细胞如425.3-PE是利用EGF的单克隆抗体同毒素PE的化学联结构建的免疫毒素(Engebraaten et al，2002)TP40是一种TGF和删除变异的PE构建的融合蛋白(Siegall et al，1989)一种治疗肿瘤的药物，它的活性成分是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质本发明序列表中序列2的蛋白质由466个氨基酸残基组成，具有抑制肿瘤的作用需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备上述药物的用量一般为每天100ug/kg体重编码上述重组蛋白的是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列本发明序列表中序列1的DNA序列由1401个碱基组成本发明用于构建重组融合蛋白的白喉毒素是一种含有两个亚基的蛋白毒素，N末端亚基(1-388残基)能够通过催化elongation factor 2的ADP-ribosylation而致蛋白合成障碍，从而导致细胞凋亡，C-末端亚基用于联接受体白喉毒素对哺乳动物细胞具有高细胞毒性，数分子的白喉毒素将足以杀死一个细胞本发明所构建的重组蛋白是由删除了受体结合结构域的白喉毒素和人变异EGF重组表达形成的，它的特点是白喉毒素固有的毒性通过删除受体结合结构域而大大降低，所以毒素将只特异地杀伤具有载体受体的细胞，对其他正常人体组织细胞无伤害，本发明改造的变异的EGF提高了对受体EGFR和HER2的粘附亲和力，同时也表现了对HER3和HER4的粘附亲和力，扩大了杀伤肿瘤细胞的范围，可以有效杀伤过表达EGFR、HER2、HER3或HER4的细胞体外体内实验研究显示，本发明的重组白喉毒素人表皮生长因子融合蛋白对多种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、前列腺癌、直肠结肠癌、子宫颈癌、和脑瘤具有较强的肿瘤细胞靶向杀伤作用下面结合具体实施例对本发明做进一步说明2、人表皮生长因子基因从人脾脏cDNA文库经PCR获得，一对引物的序列如下1GGACTTCATATGTCTCACCTGGTTAAATGCCCGCTGTCCCACG2GGGCTCGAGTTAACGCAGTTCCCACCATTTCAGATCACGG该表皮生长因子的前五个氨基酸残基突变成了SHLVKPCR产物用限制性核酸内切酶NheI和XhoI按New England BioLabs所述方法消化该嵌入物用T4连接酶连接入消化的28bDT388载体生成的质粒命名为28bDT388mEGF3、质粒28bD T388mEGF转化入大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白表达转化的大肠杆菌接种于含20μg/ml卡那霉素的10ml LB培养基，37℃摇床生长12小时，取10ml上述LB培养基转种子1L含20μg/ml卡那霉素的LB培养基，当培养基OD600值达0.6时，加入0.5ml 1M IPTG于1L培养基中诱导蛋白表达，诱导3小时后收集细胞4、收获于1L培养基中的大肠杆菌细胞离心沉淀并重悬于100ml 100mM Tris缓冲液中(pH7.9)；150mM NaCl4℃超声波裂解细胞，细胞碎片及不溶物用BeckmanJA20转子于15000rpm条件下离心沉淀，因为表达蛋白是组氨酸标记的，因此可以比较容易地通过金属螯合柱纯化5、离心后的上清液泵入10ml树脂的Ni柱，Ni柱用50mM Tris缓冲液(pH7.9)、0.5M NaCl和50mM imidazole充分冲洗柱子除去杂蛋白，被柱子结合的重组蛋白将被50mM Tris缓冲液(pH7.9)，0.5M NaCl和200mM imidazole洗脱6、洗脱的重组蛋白用2L PBS缓冲液透析，并用安装于Pharmacia公司AKTA HPLC系统的Superdex 200凝胶过滤柱进一步纯化，得到成品实施例2、本发明重组蛋白对癌细胞的作用以DT388为对照，用本发明重组蛋白分别对乳腺癌(MCF-7)、肺癌(H125，H358)、直肠癌(SW480)、子宫颈癌(A431)和脑瘤(U251，U87，U373)八株肿瘤细胞做量效关系试验，融合蛋白与DT388的IC50(ng/ml)结果如表1所示表1.重组蛋白与DT388处理各种肿瘤细胞IC50(ng/ml)MCF-7 H125H358SW480 A431U251U87 U373重组蛋白 2.5 17.515.02.5 2 15 20 25.0对照 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000 ＞1000注IC50是所处理细胞半数死亡的蛋白浓度. 从表中的数据可以看出，本发明的重组蛋白对乳腺癌、肺癌、直肠癌、子宫颈癌、脑瘤等多种肿瘤细胞株均有明显的杀伤作用序列表<160>2<210>1<211>1401<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60atggctagcg gcgctgatga tgttgttgat tcttctaaat cttttgtgat ggaaaacttt 120tcttcgtacc acgggactaa acctggttat gtagattcca ttcaaaaagg tatacaaaag 180ccaaaatctg gtacacaagg aaattatgac gatgattgga aagggtttta tagtaccgac 240aataaatacg acgctgcggg atactctgta gataatgaaa acccgctctc tggaaaagct 300ggaggcgtgg tcaaagtgac gtatccagga 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Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu155 160 165Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys170 175 180Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys185 190 195Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala200205 210Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile 215 220 225Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile230 235 240Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu245 250 255Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu260 265 270Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu275 280 285Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn290 295 300Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu305 310 315Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu320 325 330Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His335 340 345His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser350 355 360Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp365 370 375Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu380 385 390Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro395 400 405Gly His Lys Thr Gln Pro His Met Ser His Leu Val Lys Cys Pro410 415 420Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly Val Cys Met Tyr425 430 435Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val Val Gly Tyr440 445 450Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp Glu Leu455 460 465Arg46