专利名称：一种小分子非编码RNA基因hsa-miR-29b及其应用的制作方法癌症(恶性肿瘤)已成为一个全球性公共健康问题，在我国尤为突出。卫生部报 道，中国城乡居民的癌症死亡率在过去30年中增长了八成以上。目前，癌症已经成为中国 城市居民的首位死因和农村居民的第二位死因。其中，原发性肝细胞肝癌(h印atocellular carcinoma,HCC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发生率和死亡率均高居各种恶性 肿瘤前列。中国是肝癌的高发区，占全世界HCC患者总数的55%。现今恶性肿瘤主要的治 疗方法以根治性切除为主，癌症难以根治的主要原因是局部复发和远处转移，转移癌是肿 瘤复发的主要原因。众所周知，血行转移是肿瘤转移的主要途径，所以以血管生成为治疗靶 标可以有效抑制肿瘤转移，这也是目前肿瘤学研究亟待解决的问题。恶性肿瘤都是高度血 管化的，血管生成在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。新生的血管不仅为肿瘤细胞提供 营养，也为肿瘤细胞的扩散和转移提供了渠道，故抗血管生成是一种有效的抗肿瘤方法。一 些抑制血管生成的药物，如多吉美，已经广泛应用于抗肝癌。小分子非编码RNA，也称微小RNA(microRNA)，是广泛存在于各种生物体内的一 类小分子非编码的核糖核酸，长度约为20-22个碱基。它通过碱基配对识别靶基因信使 RNA(mRNA)的3’端非翻译区(3’ UTO)，促进靶基因降解或抑制其翻译来实现对基因表达的 负调控，从而参与了细胞的多种生物学过程。多个证据表明，microRNA的异常表达和功能 失调直接影响着恶性肿瘤的发生发展。现有研究发现，一种命名为hSa-miRj9b的小分子非编码RNA的表达在肝细胞肝 癌组织标本中普遍下调，并且hsa-miR-29b表达低的患者无瘤生存时间显著较短，提示其 与肝癌复发相关。而现有的国内外文献中至今未见有关hsa-miR-29b与肿瘤血管生成的研 究报道。进一步研究hsa-miR-29b在肿瘤血管生成中的作用，对于制备新型抗血管生成、抗 血行转移和抗肿瘤药物意义重大。
本发明的目的在于提供一种小分子非编码RNA基因，该基因命名为hSa-miRj9b， 其序列如序列表<400>1序列所示。本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物 中的应用。本发明的另一目的在于提供hSa-miRj9b在制备抗肿瘤血管生成药物中的应用。本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明的另一目的在于提供hsa-miR-29b在制备抗肿瘤血行转移中的应用。本发明通过体外管形成实验研究hsa-miR-29b在体外恢复表达对肿瘤细胞促血 管生成功能的作用。体外管形成实验是在体外模拟血管内皮细胞在体内形成管腔结构的实验，通过管状结构的节点数来评估人脐静脉内皮细胞HUVEC出芽能力并表征人脐静脉内皮 细胞HUVEC的血管生成能力。上述体外管形成实验设A、B、C、D、E五个实验，上述五个实验内均设置空白对照 组、阴性对照组和实验组。步骤一利用目的RNA转染肿瘤细胞株，使目的RNA在肿瘤细胞株内恢复表达，空 白对照组的肿瘤细胞株不转染任何RNA ；上述目的RNA为hsa-miR19b、hsa-miR-29b的反义核苷酸(也称为 anti-hsa-miR-29b)、阴性对照RNA (也称为NC)、阴性对照RNA的反义核苷酸(也称为 ant i-NC)其中的一种。上述肿瘤细胞株为肝细胞肝癌细胞株LM6 (简称LM6)、肝细胞肝癌细胞株H2M(简 称H2M)、肺巨细胞癌细胞株95D (简称95D)或结肠腺癌细胞株HCTl 16 (简称HCTl 16)其中 的一种。上述NC 序列为 UUCUCCGAAC⑶⑶CACCTdTdT。步骤二 收集步骤一的肿瘤细胞培养上清孵育人脐静脉内皮细胞HUVEC，孵育后 在显微镜下观察人脐静脉内皮细胞HUVEC网状结构的生成情况。实验A:空白对照组加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入NC的LM6肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的LM6肿瘤细胞培养上清；实验B:空白对照组加入未经转染的H2M肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入转染NC的H2M肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的H2M肿瘤细胞培养上清；实验C 空白对照组加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入转染了 anti-NC的LM6肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染了 anti-hSa-miRj9b的LM6肿瘤细胞培养上清；实验D 空白对照组加入未经转染的95D肿瘤细胞培养上清； 阴性对照组加入NC的95D肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的95D肿瘤细胞培养上清；实验E 空白对照组加入未经转染的HCTl 16肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入NC的HCTl 16肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的HCTl 16肿瘤细胞培养上清；对实验结果进行对比分析及相关性统计表明实验A中，相对于阴性对照组和空 白对照组，实验组的肿瘤细胞培养上清明显抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构的形 成；实验B、实验D和实验E的结果与实验A相同。而在实验C中，相对于阴性对照组和空 白对照组，实验组中肿瘤细胞内源表达的hsa-miR-29b被转染后表达的ariti-hsa-miRj9b拈抗后，收集的肿瘤细胞培养上清更显著的促进了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构的形 成。管状结构的节点数与hsa-miR-29b表达水平呈负相关。体外管形成实验结果表明，hsa-miR-29b可抑制肿瘤细胞的促血管生成能力，且该 抑制肿瘤细胞的促血管生成能力的性能不具有肿瘤特异性。本发明通过裸鼠成瘤及免疫组化实验研究hsa-miR-29b在体内表达对肿瘤细胞 生长和促血管生成的影响。具体实验步骤为(1)细胞转染将目的RNA (NC或hsa_miR19b)转染肿瘤细胞株，使目的RNA在肿 瘤细胞株内恢复表达；(2)裸鼠成瘤收集步骤(1)中恢复表达的肿瘤细胞对BALB/c裸鼠进行皮下注 射，选取5只BALB/c裸鼠，在每只BALB/c裸鼠的两只后腿分别注射实验组和阴性对照组的 肿瘤细胞，连续观察并测量肿瘤的大小至1个月以上。观察完毕后完整剥离肿瘤组织，制成 石蜡切片4°C保存。(3)免疫组化将步骤( 得到的裸鼠肿瘤组织切片和人肝癌组织切片分别进行 免疫组化染色后在显微镜下观察肿瘤组织中血管生成情况。上述步骤(2)裸鼠成瘤设置阴性对照组和实验组。阴性对照组的肿瘤细胞株中转 染NC，实验组的肿瘤细胞株中转染hSa-miRj9b。上述步骤( 裸鼠成瘤所采用的肿瘤细胞株为肝细胞肝癌细胞株LM6。上述步骤(3)人肝癌组织切片中hSa-miRj9b的表达水平通过实时定量PCR (也 称为 realtime PCR)测定。裸鼠成瘤及对裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化结果相对于阴性对照组，实验组肿 瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长速率明显较低，体积较小；且实验组肿瘤组织中形成的 微血管密度明显较高，肿瘤细胞表达的hsa-miR-29b浓度与微血管密度呈显著负相关。对人肝癌组织切片的免疫组化结果hSa-miR-29b表达水平高的人肝癌组织切片 血管管径明显较小且血管密度明显较低。人肝癌组织切片中hsa-miR-29b浓度与微血管密 度的相对统计结果显示，两者呈显著负相关。裸鼠成瘤及免疫组化实验结果表明，体内恢复小分子非编码RNA基因 hsa-miR-29b表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力，而且显著抑制了肿瘤血管 生成能力，从而抑制肿瘤的血行转移。综上所述，本发明提供的hsa-miR-29b在制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物、抗 肿瘤血管生成药物、抗肿瘤药物以及抑制肿瘤血行转移药物方面都有广泛应用。图1为体外管形成实验中经肿瘤细胞上清孵育后的人脐静脉内皮细胞HUVEC在 100倍显微镜下成像图及其管状结构的相对节点数统计图。图1A、图1B、图IC分别对应实 施例1中的实验A、B、C的实验结果。图1A、图IB和图IC从左至右依次为空白对照组、阴 性对照组和实验组的显微镜成像图，最右侧为相对节点数统计图。图2为体外管形成实验中经肿瘤细胞上清孵育后的人脐静脉内皮细胞HUVEC在 100倍显微镜下成像图及其管状结构的相对节点数统计图。图2A采用的肿瘤细胞为肺巨细胞癌细胞株95D，图2B采用的肿瘤细胞为结肠腺癌细胞株HCT116。图2A和图2B从左至右 依次为空白对照组、阴性对照组和实验组的显微镜成像图；最右侧为相对节点数统计图。图3为裸鼠成瘤及裸鼠肿瘤组织免疫组化结果图。图3A为从裸鼠皮下分离出来 的肿瘤成像图；图3B为肿瘤生长曲线图；图3C为⑶34标记的裸鼠肿瘤组织切片血管内皮 细胞在显微镜下成像图，图3D为裸鼠肿瘤组织切片hsa-mir-29b表达水平与微血管密 度相关性分析图。图4为人肝癌组织免疫组化示意图。图4A为⑶34标记的人肝癌组织血管内皮细 胞于100倍镜下成像图；图4B为人肝癌组织切片中has-mir-2%表达水平与微血管密度的 相关性分析图。
1. 2管形成检测按照步骤1. 1在肿瘤细胞株中恢复目的RNA的表达，收集转染后恢复表达的肿瘤 细胞培养上清，与人脐静脉内皮细胞HUVEC共培养。上述目的RNA可为hsa-miR19b、hsa-miR-29b的反义核苷酸(简称 anti-hsa-miR-29b)、阴性对照RNA (简称NC)、阴性对照RNA的反义核苷酸(简称anti_NC) 其中的一种。本实施例中采用的肿瘤细胞株选自肝细胞肝癌细胞株LM6 (简称LM6)、肝细胞肝 癌细胞株H2M (简称H2M)、肺巨细胞癌细胞株95D (简称95D)或结肠腺癌细胞株HCTl 16 (简 称HCTl 16)其中的一种。本实施例中LM6出自上海细胞所；H2M出自香港大学；95D从中科院细胞中心购 得；HCT116出自Bert Vogelstein&Kenneth W. Kinzler实验室。本实施例中未标明具体来 源的试剂与材料均为市售标样。人脐静脉内皮细胞HUVEC为本实验室按本领域常规方法制备以人脐带(出自中 山大学附属第二医院)为原材料，将内皮细胞从脐静脉中用胰酶(购于广州展晨公司)消 化出来后，贴于培养瓶培养。本实施例共设A、B、C、D、E五个实验，每个实验中均设置空白对照组、阴性对照组 和实验组。实验A 空白对照组加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入NC的LM6肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的LM6肿瘤细胞培养上清；实验B 空白对照组加入未经转染的H2M肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入转染NC的H2M肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的H2M肿瘤细胞培养上清；实验C 空白对照组加入未经转染的LM6肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入转染了 anti-NC的LM6肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染了 anti-hSa-miRj9b的LM6肿瘤细胞培养上清；实验D 空白对照组加入未经转染的95D肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入NC的95D肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的95D肿瘤细胞培养上清；实验E 空白对照组加入未经转染的HCTl 16肿瘤细胞培养上清；阴性对照组加入NC的HCTl 16肿瘤细胞培养上清；实验组加入转染hSa-miRj9b的HCTl 16肿瘤细胞培养上清；具体实验步骤为(1)取96孔板，以每孔1.2 X IO4个人脐静脉内皮细胞HUVEC (细胞悬液肿瘤细胞培养上清=25% 75% )贴于预包被Matrigel (R&D，MN, USA)的孔中；于37°C孵育10 小时；(2)显微镜下观察加入不同肿瘤细胞培养上清的各实验组内皮细胞的管形成情 况。通过对管状结构节点的计数表征肿瘤细胞促血管生成能力的强弱。所有实验组都是计 数复孔，以三次重复实验取平均值。1. 3结果分析实验A、实验B和实验C的实验结果如图1所示。图IA为实验A的结果示意图，图 IB为实验B的结果示意图，图IC为实验C的结果示意图；实验D和实验E的实验结果如图 2所示，图2A为实验D的结果示意图，图2B为实验E的结果示意图。实验A、实验B、实验D、实验E结果分析实验A结果如图IA所示，显微镜下空白对 照组和阴性对照组的人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度差异不大，而实验组的 人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度相对于空白对照组和阴性对照组明显较低； 人脐静脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构的节点数与hsa-miR-29b的表达浓度的相对性统 计结果表明，肿瘤细胞上清中hsa-miR19b的表达水平与上述管状结构的节点数呈显著负 相关。实验B、实验D、实验E的实验结果，分别如图1B、图2A、图2B所示，与实验A的实验 结果相同。说明肿瘤细胞上清中hsa-miRj9b的表达明显抑制了人脐静脉内皮细胞HUVEC 的管状结构形成。实验C的结果分析如图IC所示，显微镜下空白对照组和阴性对照组的人脐静 脉内皮细胞HUVEC形成的管状结构密度差异不大，而实验组的人脐静脉内皮细胞HUVEC 形成的管状结构密度相对于空白对照组和阴性对照组明显较高；人脐静脉内皮细胞 HUVEC形成的管状结构的节点数与anti-hsa-miR-29b表达浓度的相对性统计结果表明， anti-hSa-miR-29b的表达水平与上述管状结构的节点数呈显著正相关。说明肿瘤细胞上清 中肿瘤细胞内源表达的hsa-miR-29b被转染后表达的anti-hsa-miR-29b拈抗后，收集的肿 瘤细胞上清更显著的促进了人脐静脉内皮细胞HUVEC管状结构形成。结果显示，hsa-miR-29b可抑制肿瘤细胞的促血管生成能力，且该抑制肿瘤细胞的 促血管生成能力的性能不具有肿瘤特异性。实施例2裸鼠成瘤及免疫组化实验2.1细胞转染利用hvitrogen公司的转染试剂Lipofectamine RNAi MAX转染目的 RNA(hsa-miR-29b或NC)到肝细胞肝癌细胞株LM6 (简称LM6，出自上海细胞所)，目的RNA 终浓度为50nM，培养4 后用胰酶消化并计数后按1 X IO7个/ml的浓度用PBS重悬。本实 施例中未标明具体来源的试剂与材料均为市售标样。2. 2裸鼠成瘤选用5只5周龄的BALB/c裸鼠，在其两只后腿分别皮下注射IX IO6恢复 hsa-miR-29b或NC表达LM6肿瘤细胞。连续观察并测量肿瘤的大小至1个月以上。完整剥 离所有裸鼠的肿瘤组织，按本领域常规方法制成石蜡切片4°C保存。2. 3免疫组化本实施例对步骤2. 2中得到的裸鼠肿瘤组织切片进行免疫组化，利用特异性的 CD34抗体标记血管内皮细胞，通过显色原理使被标记的血管内皮细胞显色并使用显微镜观察肿瘤组织切片中血管生成情况。同时按相同原理对人肝癌组织切片进行免疫组化，观察 人肝癌组织切片中的血管生成情况。上述人肝癌组织切片取自中山大学附属肿瘤医院标本库，人肝癌组织切片中 hsa-miRj9b的表达水平事先通过实时定量PCR(也称为real time PCR)测定。免疫组化步骤为(1)预处理取出55 °C烤片lh，放于二甲苯中脱蜡两次，每次IOmin ；依次用 100 %、95 %、90 %、80 %、70 %的乙醇洗一次，每步3min，后用双蒸水洗!Bmin ；0. 3 %的双氧 水处理lOmin，双蒸水再洗3次，每次3min ；浸泡于修复液中，用微波炉进行热修复，室温冷 却半小时；用IXPBS洗三次，每次:3min ；(2)杂交染色用人或鼠特异性的-⑶34抗体进行孵育，4°C过夜；恢复室温，弃去 抗体液，用IXPBS洗三次，每次5min ；加入二抗，37°C半小时；用1 XPBS洗三次，每次5min ； 加入DAB显色液进行显色，然后用苏木精复染；(3)计数微血管密度(MVD)计数，先寻找血管最密集区，然后在100倍镜下观察 染成棕色的单个细胞或连续细胞丛，并以此计为一个血管，以5个视野的均数表示该标本 的微血管密度。2. 4结果分析裸鼠成瘤以及对裸鼠肿瘤组织切片的免疫组化结果如图3所示，恢复 hsa-miR-29b表达的实验组肿瘤细胞在裸鼠体内形成的肿瘤生长速率明显较低，体积较小 (见图3A和图;3B)；且实验组肿瘤组织中形成的微血管密度相对于阴性对照组明显较高， 肿瘤细胞表达的hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结果显示，两者呈显著负相关 (图3C和图3D)。类似地，对人肝癌组织切片的免疫组化结果如图4所示，通过免疫组化标记血管 内皮细胞，可以发现hsa-miR-29b高表达的人肝癌组织切片的血管管径明显较小且血管密 度明显较低(见图4A)。人肝癌组织切片中hsa-miR-29b浓度与微血管密度的相对统计结 果显示，两者呈显著负相关(见图4B)。综上所述，恢复hsa-miR-29b表达不仅可以显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力， 而且显著抑制了肿瘤血管生成能力，从而可抑制肿瘤细胞通过血行途径形成转移瘤。


本发明提供一种小分子非编码RNA(该小分子非编码RNA命名为hsa-miR-29b)及其应用。本发明进行了体外管形成实验和裸鼠成瘤及免疫组化实验，体外管形成实验的结果表明体外恢复hsa-miR-29b表达可显著抑制肿瘤细胞诱导的血管生成；裸鼠成瘤及免疫组化实验的结果表明体内恢复hsa-miR-29b表达可显著抑制肿瘤细胞的体内成瘤能力和肿瘤血管生成能力，从而抑制肿瘤血行转移。因此，hsa-miR-29b可用于制备抑制肿瘤细胞促血管生成药物、抗肿瘤血管生成药物、抗肿瘤药物和抗肿瘤血行转移药物。