专利名称：一种通用植物总rna提取法的制作方法植物不仅是整个地球生态系统的重要组成部分，而且还是人类食物和工业原材料的重要来源。随着生活水平的提高，居住环境日益恶化，有限非再生资源的逐渐耗竭，不同领域的研究人员在分子水平上对植物进行着深入研究，以解决当前人类所面临的粮食、环境和能源问题。由此，各种形式的植物分子生物学研究在世界范围内展开。RNA是植物体内重要生物大分子之一，参与植物结构组成、蛋白合成、基因表达调控等，因此众多植物分子实验需对不同来源、不同生长期、不同处理、不同组织样本的RNA进行分离、纯化，如EST和全长cDNA文库构建，RT-和实时定量PCR，基因芯片分析，SAGE, RACE, Northern杂交等等。而分离、纯化RNA的质量则是这些实验成败的关键。目前市场上出售的植物RNA提取试剂及试剂盒种类很多，但这些试剂盒和试剂往往都存在提取效率低，广谱性差，提取的总RNA有多糖、蛋白和多酚的污染，降解，价格昂贵等缺点。因此，提取植物完整的总RNA往往成为各大闻校、研究院等研究人员最头疼的问题。解决的技术问题从各种植物材料(尤其是含多糖、多酚)的任何组织中提取完整的总RNA。
该方法提取液主要由两种特殊的变性剂组成，两种变性剂相互作用，能有效地抑制提取体系中的RNA酶活性，一种变性剂在氯仿和酚混合液存在条件下不稳定容易沉淀，并且可以与多糖多酚形成复合物，另一种变性剂在氯仿和酚混合液存在条件下相当稳定，但不与多糖和多酚形成复合物，优化后的提取液使蛋白的可溶性大大降低。因此，通过样品、提取液、氯仿和酚相互混合剧烈振荡条件下能彻底破坏植物细胞组织，有效地去除多糖、多酚和蛋白。再在优化后的沉淀剂的作用下特异地沉淀体系中的总RNA。提取的具体过程如下I.在I. 5ml离心管中按先后顺序加入350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul提取液.2.向离心管中加入液氮中粉碎后的植物材料< 0. lg，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min. (PVPP粉末可加可不加，加后有利于改善提取后总RNA的质量)3. 13000rpm, 4°C离心 6_8min。4.向另一 I. 5ml离心管加350ul Tris-饱和酹和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.5. 13000rpm, 4°C离心 5min。6.取上清至另一含700ul氯仿的I. 5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min.7. 13000rpm, 4°C离心 6_8min。8.取一无RNA酶污染的I. 5ml离心管，加450ul沉淀剂。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min.9. IOOOOrpm(约 9000-10000Xg)，4°C离心 IOmin010.弃上清,加Iml 75%乙醇,涮洗管壁后14000rpm, 4°C离心5min。弃乙醇,气干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取2ul电泳检测。(如果需要，可加I倍体积的氯仿处理一次，去除残余蛋白，用1/10体积乙酸钠和3倍体积乙醇沉淀回收总RNA，260/280比值一般都能大于2. 0)。与以往技术相比有益效果该方法提取的植物总RNA无蛋白污染、多糖、多酚污染，并且不存在降解问题，0D260/0D280 一般在2. 0-2. 2之间，电泳图谱中28S和18S rRNA条带的亮度比值大于2。实例I提取杨树花芽总RNA以杨树花芽为材料提取总RNA，杨树花芽富含多糖、多酚和黄酮类物质，用好多商业化的试剂盒很难提取无多糖、多酚和蛋白污染的总RNA.11.在I. 5ml离心管中按先后顺序加入350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul溶液I和IOOul2-巯基乙醇.12.向离心管中加入液氮中粉碎后的杨树花芽粉末0. 1-0. 25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨过程中可加1/5质量的PVPP粉末)13. 13000rpm，4°C离心 6_8min。14.向另一 I. 5ml离心管加350ul Tris-饱和酹和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.15. 13000rpm, 4°C离心 5min。I.取上清至另一含700ul氯仿的I. 5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min.2. 13000rpm，4°C离心 6_8min。3.取一无RNA酶污染的I. 5ml离心管，加450ul溶液II。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min.4. IOOOOrpm(约 9000-10000X g)，4。。离心 IOmin05.弃上清，加Iml 75%乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4°C离心5min。6.弃乙醇,气干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取Iul电泳检测。实例2提取月季叶片总RNA以为月季叶片材料提取总RNA，杨树花芽富含多糖、多酚和黄酮类物质，用商业化的试剂盒很根本提取不出总RNA。7.在I. 5ml离心管中按先后顺序加入350ul Tris-饱和酚，350ul氯仿，700ul溶液I和100ul2-巯基乙醇. 8.向离心管中加入液氮中粉碎后的月季叶片粉末0. 1-0. 25g，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡15-25min.(如果材料多酚含量高，可在液氮研磨过程中可加1/5质量的PVPP粉末)9. 13000rpm, 4°C离心 6_8min。10.向另一 I. 5ml离心管加350ul Tris-饱和酚和350ul氯仿。将步骤3离心后的上清液完全转移至该离心管内，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈震荡5min.11. 13000rpm, 4°C离心 5min。 12.取上清至另一含700ul氯仿的I. 5ml离心管中，盖紧盖后迅速在震荡器上剧烈充分震荡5min.13. 13000rpm，4°C离心 6_8min。14.取一无RNA酶污染的I. 5ml离心管，加450ul溶液II。将步骤7离心后的上清液(700ul)转移至该离心管，上下颠倒5-10次，冰浴4-8min.15. IOOOOrpm(约 9000-10000X g)，4。。离心 IOmin016.弃上清，加Iml 75%乙醇，涮洗管壁后14000rpm，4°C离心5min。17.弃乙醇,气干后加100ulRNase-free水,充分溶解沉淀,取Iul电泳检测。
本发明公开了一种通用的植物总RNA提取的方法。RNA样品中不含有破坏RNA和抑制逆转录和PCR反应的因子。该方法广泛的适用于各类植物总RNA的提取、纯化及制备之用。而且可以对不同来源、不同生长期、不同处理、不同组织样本的RNA进行分离、纯化。尤其是普通方法难以提取的富含多糖、多酚的植物的总RNA的理想提取方法。