专利名称：一种鉴别烟草品种的scar标记引物及其方法工商分离后，云南烤烟的大量调出及烤烟品种的单一、老化，使云产卷烟原有的原料优势正逐渐消失，造成云产卷烟品牌与省外品牌在产品风格上出现同质化，使原料成为严重制约云产卷烟发展的瓶颈之一。红云红河集团原料差异化项目的实施，从新品种选育和国外品种引进两方面同时着手，一定程度上改善了这种状况。但是，由于不同烟叶品种在卷烟配方中所起作用不同，随之而来对于烟叶品种间的鉴别问题亟待解决。到目前为止，对于品种间差异性的鉴定仅限于根据烟叶外观质量进行评价，尤其在烟叶生产、收购、复烤、 仓储过程中，没有形成一套科学的跟踪监测体系，导致一系列的品种混杂、错标等现象，严重影响云产卷烟产品质量和风格的稳定。SCAR (Sequence-characterized Amplified Regions),即序列特异性扩增区标记，由RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)等分子标记转化而来，是一种扩增稳定、 结果重复性好、操作简便、应用广泛的分子标记，SCAR标记能从DNA水平上反映物种之间遗传差异。采用SCAR标记对不同烟草品种基因组DNA进行分析，建立烟草品种DNA指纹图谱， 可以快速、准确地从烟草DNA水平上对烟草品种进行鉴定。由于卷烟风格与烟叶品种有直接关系，对烟叶品种的要求越来越高。因此，为了防止由于烟叶品种不符而造成卷烟风格的变化，建立烟草品种的SCAR标记技术是十分必要的。本项目研究拟从RAPD转化为SCAR标记，建立烟草品种的SCAR标记技术和红云红河常用烟草品种SCAR指纹图谱库，严格控制烟叶品种的准确性，不断彰显和强化集团在原料方面的品种特色和竞争优势。对集团品牌的强势扩张、产品结构的全面提升优化，具有十分重要的现实意义。
本发明的目的在于提供一种SCAR标记鉴别红云红河集团12个常用烟草品种的方法。本发明采用的技术方案是一种鉴别烟草品种的SCAR标记引物，采用RAPD对12 个烟草品种进行分析，得到6条特异片段，基于6条特异片段核苷酸序列设计6对SCAR引物，所述12个烟草品种为红花大金元、K326、NC102、NC297、云烟85、云烟87、云烟97、中烟 100、翠碧I号、KRK26、龙江911和南江3号，所述6对SCAR引物分别为Sl-F GTCCACACGGGGCAATTAATG/Sl-R GTCCACACGGCTATGAGATTA, PCR 产物大小为 545bp ；S2-F CACGGCTGCGTGTTATGAAC/S2-R CACGGCTGCGAAGAGCTAAG, PCR 产物大小为 733bp ；S3-F CAATCGCCGTAAATACACAAAGTA/S3-R AATCGCCGTCAGGAGAGAGA, PCR 产物大小为 887bp ；S4-F CCACAGCAGTAACAGCAGGA/S4-R CCACAGCAGTCTGATATTGGATG, PCR 产物大小为 313bp ；S5-F AGGCTGTGCTATTGTAGGATGAGAC/S5-R AGGCTGTGCTTACTGCTTCTAC, PCR 产物大小为 555bp ；S6-F TTTGAGAATACGTCTTAACGACCA/S6-R CCACAGCAGTCCCTTCCTAA, PCR 产物大小为 1760bp。所述的鉴别烟草品种的SCAR标记方法，利用CTAB法提取12个烟草品种基因组 DNA,采用6对引物分别对12个烟草品种基因组DNA进行PCR扩增，通过6张SCAR图谱的分析，建立12个烟草品种的分子ID，根据分子ID的不同，将12个烟草品种逐一鉴别，所述 PCR 扩增 20 μ L 反应体系为50ng/μ LDNA 模板 0.7 μ L，10XPCR Buffer 2yL，25mmol/L MgCl2L 6μ L，lOmmol/L dNTP I μ L，10 μ mol/L 上下游引物各 0. 5 μ L，5U/μ L Taq 0. 5 μ L, ddH20 14. 2μ L，所述12个烟草品种的分子ID为红花大金元=011001 ；K326 :010001 ； NC102,011000 ；NC297,100100 ;云烟 85，110101 ;云烟 87,010101 ;云烟 97,010110 ；中烟 100，110011 ;翠碧 I 号，101011, KRK26,110111 ;龙江 911，100010 ;南江 3 号，100101。本发明的有益效果是建立了 SCAR标记应用烟草品种鉴定的方法；建立了 12个烟草品种的SCAR指纹图谱库；本发明中提供的方法不但可以用于卷烟原料的大田鉴定，而且可用于鉴别初烤和复烤烟叶或者叶片，成功的将SCAR标记技术应用于烟草工业生产。图I是12个烟草品种基因组DNA提取结果，I 12分别为红花大金元、K326、 NC102、NC297、云烟85、云烟87、云烟97、中烟100、翠碧I号、KRK26、龙江911和南江3号；图2是6对SCAR引物对12个烟草品种扩增结果，I 12分别代表红花大金元、 K326、NC102、NC297、云烟85、云烟87、云烟97、中烟100、翠碧I号、KRK26、龙江911和南江 3 号，M 是 250bp DNA ladder marker ；图3是5个未知品种基因组DNA提取结果，I图4是S1-F/S1-R对未知品种的扩增结果，I 250bpDNAladder marker ；图5是S2-F/S2-R对未知品种的扩增结果，I图6是S3-F/S3-R对未知品种的扩增结果，I图7是S4-F/S4-R对未知品种的扩增结果，I图8是S5-F/S5-R对未知品种的扩增结果，I图9是S6-F/S6-R对未知品种的扩增结果，I5是未知品种A、B、C、D、E ;
5是未知品种A、B、C、D、E。M是
5及M同图4 5及M同图4 5及M同图4 5及M同图4 5及M同图4,

Sl-F GTCCACACGGGGCAATTAATG/Sl-R GTCCACACGGCTATGAGATTA, PCR 产物大小为 545bp ；S2-F CACGGCTGCGTGTTATGAAC/S2-R CACGGCTGCGAAGAGCTAAG, PCR 产物大小为 733bp ；S3-F CAATCGCCGTAAATACACAAAGTA/S3-R AATCGCCGTCAGGAGAGAGA, PCR 产物大小为 887bp ；S4-F CCACAGCAGTAACAGCAGGA/S4-R CCACAGCAGTCTGATATTGGATG, PCR 产物大小为 313bp ；S5-F AGGCTGTGCTATTGTAGGATGAGAC/S5-R AGGCTGTGCTTACTGCTTCTAC, PCR 产物大小为 555bp ；S6-F TTTGAGAATACGTCTTAACGACCA/S6-R CCACAGCAGTCCCTTCCTAA, PCR 产物大小为 1760bp。所述的鉴别烟草品种的SCAR标记方法，利用CTAB法提取12个烟草品种基因组 DNA,采用6对引物分别对12个烟草品种基因组DNA进行PCR扩增，通过6张SCAR图谱的分析，建立12个烟草品种的分子ID，根据分子ID的不同，将12个烟草品种逐一鉴别，所述 PCR 扩增 20 μ L 反应体系为50ng/μ LDNA 模板 0.7 μ L，10XPCR Bufier 2yL，25mmol/L MgCl2L 6μ L，10mmol/L dNTP I μ L，10 μ mol/L 上下游引物各 0. 5 μ L，5U/μ L Taq 0. 5 μ L, ddH20 14. 2μ L，所述12个烟草品种的分子ID为红花大金元=011001 ；K326 =010001 ； NC102,011000 ；NC297,100100 ;云烟 85，110101 ;云烟 87，010101 ;云烟 97，010110 ;中烟 100，110011 ;翠碧 I 号，101011, KRK26,110111 ;龙江 911，100010 ;南江 3 号，100101。采用6对SCAR引物建立12个烟草品种指纹图谱和分子ID的方法。该方法以红花大金元、K326、NC102、NC297、云烟85、云烟87、云烟97、中烟100、翠碧I号、KRK26、龙江 911和南江3号12个烟草品种的复烤烟叶为研究材料，首先进行基因组DNA提取，然后进行 SCAR-PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳，得到并分析12个烟草品种的SCAR指纹图谱， 建立12个烟草品种的分子ID。具体包括以下步骤I.烟叶基因组DNA提取(I)向盛有样品(O. I O. 2g)的I. 5ml离心管中，加入700 μ L O. 75 X CTAB提取缓冲液，混匀，65°C温浴IOmin以上；(2)加入700 μ L三氯甲烷/异戊醇(24 I)，混匀12000r/min离心5min ；(3)取上清，加1/10体积10% CTAB提取缓冲液，再加入等体积三氯甲烷/异戊醇 (24 : I),混勻，12000r/min 离心 5min ;(4)取上清,加等体积的Tris平衡酹,混勻12000r/min离心5min ；(5)取上清，加入 I μ L RNase (20mg/mL), 37。。温浴 IOmin ；(6)加入等体积三氯甲烧/异戍醇(24 : I),混勻，12000r/min离心5min ;(7)取上清,加I. 5倍体积的CTAB沉淀缓冲液,混勻，12000r/min离心15min ；(8)去其上清，加入100 μ L高盐TE，65°C温浴IOmin ；(9)加入二倍体积冷的无水乙醇，-20°C冰箱保存30min ；(10) 12000r/min 离心 15min，沉淀溶于 50 μ L 超纯水中。2. SCAR-PCR 扩增
SCAR-PCR 扩增 20 μ L 反应体系中包括 50ng/ μ LDNA 模板 O. 7 μ L，10XPCR Buffer 2μ L,25mmol/L MgCl2 I. 6 μ L, 10mmol/L dNTP I μ L，10 μ mol/L上下游引物各O. 5 μ L，5U/ μ L TaqO. 5 μ L，ddH20 14. 2μ L。反应程序:94°C 预变性 6min ;之后 94°C 变性 50s，退火 20s， 72°C延伸，反应进行35个循环；然后72°C延伸6min，4°C保温。扩增产物用1XTAE，2.0% 的琼脂糖凝胶，在100V稳定电压下电泳Ih左右。3. SCAR 图谱PCR产物电泳后利用凝胶成像系统拍照，建立SCAR图谱。SCAR标记特征S1-F/S1-R标记特征S1-F/S1-R在红花大金元、K326、NC102、云烟87和云烟97中没有扩增，而在NC297、云烟85、中烟100、翠碧I号、KRK26、龙江911和南江3号中扩增出 545bp条带。S2-F/S2-R标记特征S2_F/S2_R在NC297、翠碧I号、龙江911和南江3号中没有扩增，而在红花大金元、K326、NC102、云烟85、云烟87、云烟97、中烟100和KRK26中扩增出 733bp条带。S3-F/S3-R 标记特征S3_F/S3-R 在 K326、NC297、云烟 85、云烟 87、云烟 97、中烟 100、KRK26、龙江911和南江3号中没有扩增，而在红花大金元、NC102和翠碧I号中扩增出 887bp条带。S4-F/S4-R标记特征S4_F/S4_R在红花大金元、NC102、K326、中烟100、翠碧I号和龙江911中扩增条带缺失，而只在NC297、云烟85、云烟87、云烟97、KRK26、和南江3号中扩增出313bp条带。S5-F/S5-R 标记特征S5_F/S5-R 在红花大金元、NC102、K326、NC297、云烟 85、云烟87和南江3号中缺失，而只在云烟97、中烟100、翠碧I号、KRK26和龙江911中扩增出 555bp条带。S6-F/S6-R标记特征S6_F/S6-R在NC102、NC297、云烟97和南江3号中缺失，而在红花大金元、K326、云烟85、云烟87、中烟100、翠碧I号、KRK26和南江3号中扩增出1760bp条带。4. 12个烟草品种分子ID根据12个烟草品种的6张SCAR图谱，标识SCAR条带的存在为“ I ”，条带的缺失为 “0”，按照S1-F/S1-R S6-F/S6-R的顺序，建立了 12个烟草品种的分子ID :红花大金元: 011001 ；K326 :010001 ；NC102 :011000 ；NC297 :100100 ;云烟 85 :110101 ;云烟 87 :010101 ； 云烟 97 :010110 ;中烟 100 :110011 ;翠碧 I 号:101011 ；KRK26 :110111 ;龙江 911 :100010 ； 南江3号:100101。本发明中，根据研究材料的范围，本发明提供的方法可鉴别12个烟草品种中的任意品种。本发明中，DNA提取方法适用于新鲜烟叶，初烤烟叶，复烤叶片和仓储叶片，因此本发明中提供的SCAR标记鉴别烟草品种方法适用于大田烟叶和工业中烟叶(叶片)品种的鉴别。本实施例中5个未知烟叶样品(未知品种A、B、C、D、E)，进行未知品种基因组DNA 提取和SCAR-PCR扩增，利用红云红河集团12个常用烟叶原料SCAR指纹图谱库对5个复烤烟叶进行品种鉴定。
I.烟叶基因组DNA提取(I)向盛有样品(O. I O. 2g)的I. 5ml离心管中，加入700 μ L O. 75 X CTAB提取缓冲液，混匀，65°C温浴IOmin以上；(2)加入700 μ L三氯甲烷/异戊醇(24 I)，混匀12000r/min离心5min ；(3)取上清，加1/10体积10% CTAB提取缓冲液，再加入等体积三氯甲烷/异戊醇 (24 : I),混勻，12000r/min 离心 5min ;(4)取上清,加等体积的Tris平衡酹,混勻12000r/min离心5min ；(5)取上清，加入 I μ L RNase (20mg/mL), 37。。温浴 IOmin ；(6)加入等体积三氯甲烧/异戍醇(24 I),混勻，12000r/min离心5min ;(7)取上清,加I. 5倍体积的CTAB沉淀缓冲液,混勻，12000r/min离心15min ；(8)去其上清，加入100 μ L高盐TE，65°C温浴IOmin ；(9)加入二倍体积冷的无水乙醇，-20°C冰箱保存30min ；(10) 12000r/min 离心 15min，沉淀溶于 50 μ L 超纯水中。2. SCAR-PCR 扩增SCAR-PCR 扩增 20 μ L 反应体系中包括 50ng/ μ LDNA 模板 O. 7 μ L，10XPCR Buffer 2μ L,25mmol/L MgCl2 I. 6 μ L, 10mmol/L dNTP I μ L，10 μ mol/L上下游引物各O. 5 μ L，5U/ μ L TaqO. 5 μ L，ddH20 14. 2μ L。反应程序:94°C 预变性 6min ;之后 94°C 变性 50s，退火 20s， 72°C延伸，反应进行35个循环；然后72°C延伸6min，4°C保温。扩增产物用1XTAE，2.0% 的琼脂糖凝胶，在100V稳定电压下电泳Ih左右。
有扩增。扩增。扩增。扩增。
m
日O
m
日O
3.SCAR图谱
PCR产物电泳后利用凝胶成像系统拍照，建立SCAR图谱。
51-F/S1-R标记特征只在未知品种B和C中有扩增，而在未知品种A、D和E中没
52-F/S2-R标记特征只在未知品种A、D和E中有扩增，而未知品种B和C中没有
53-F/S3-R标记特征只在未知品种A和B中有扩增，而未知品种C、D和E中没有
54-F/S4-R标记特征在未知品种A和B中没有有扩增，而未知品种C、D和E中有
55-F/S5-R标记特征只在未知品种B中有扩增，而未知品种A、C、D和E中没有扩
56-F/S6-R标记特征在未知品种A没有有扩增，而未知品种B、C、D和E中有扩
4.分子ID
根据5个未知烟草品种的6张SCAR图谱，标识SCAR条带的存在为“ I ”，条带的缺失为“0”，按照S1-F/S1-R S6-F/S6-R的顺序，建立了 5个未知烟草品种的分子ID 未知品种A 011000未知品种B 101011未知品种C 100101
未知品种D 010101未知品种E 0101015.未知品种的确定将建立好的未知品种ID与12个烟草品种分子ID比对分析，未知品种A与NC102 分子ID相同，确定未知品种A为NC102 ;未知品种B与翠碧I号分子ID相同，确定未知品种A为翠碧I号；未知品种C与南江3号分子ID相同,确定未知品种C为南江3号；未知品种C与南江3号分子ID相同，确定未知品种C为南江3号；未知品种D和E分子ID相同, 与12个烟草品种中的云烟87分子ID相同，确定未知品种D和E都是云烟87。利用本项目中方法鉴定得到的结果与大田中鉴定结果和预期结果一致。


本发明公开了一种鉴别烟草品种的SCAR标记引物及其方法，采用RAPD对12个烟草品种进行分析，得到6条特异片段，基于6条特异片段核苷酸序列设计6对SCAR引物，所述12个烟草品种为红花大金元、K326、NC102、NC297、云烟85、云烟87、云烟97、中烟100、翠碧1号、KRK26、龙江911和南江3号。本发明建立了SCAR标记应用烟草品种鉴定的方法；建立了12个烟草品种的SCAR指纹图谱库；本发明中提供的方法不但可以用于卷烟原料的大田鉴定，而且可用于鉴别初烤和复烤烟叶或者叶片，成功的将SCAR标记技术应用于烟草工业生产。