专利名称：一种利用ssr分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法柳枝稷(Panicum virgatum)是禾本科黍属植物,植株高大,具有适应性好,耐贫瘠和对环境友好等优点，现在被作为是纤维素类能源植物中的首选植物。但其育种水平落后，分子育种可以大大加快其育种进程。杂种鉴定是遗传育种的基础工作，鉴定的真杂种可以为构建遗传图谱提供重要依据。柳枝稷是异花授粉植物，存在一定的自交率，如何快速准确鉴定出柳枝稷杂交后代的真实性是遗传育种的基础工作。除形态学鉴定外，分子标记技术被广泛运用于杂交后代的真实性鉴定。例如在文 献《结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定-SRAP分子标记》中报道的杂种鉴定的方法，利用9对具有父本特征带的引物组合对结缕草交后代的DNA进行PCR扩增反应。电泳分离扩增产物后，具有父本特征带的后代为真杂种，若无，则利用其他引物继续鉴定。在《结缕草属植物杂交后代杂种真实性鉴定-SRAP分子标记》一文中，为鉴定37个杂交后代的杂种真实性，筛选了 9对具有父本特征带的SRAP引物，利用这些引物对杂交后代DNA进行PCR扩增，电泳分离扩增产物，具有父本特异条带的杂交种为真杂种。若没有扩增出父本特异条带，则更换引物扩增。最终共利用9对引物鉴定出杂交后代中有32个为真杂种。如图I所示。03-2，03-4，03-5，03-6，03-7，03-8，03-9，03-10 和 03-11 是以 022 为母本，123 为父本的杂交后代。图中箭头所指接近300bp的条带为父本特异条带。则03-2，03-4，03-5，03-7，03-9和03-11具有父本特异条带，为真杂种。其余杂交后代需利用其他引物继续鉴定。SRAP分子标记技术属于显性标记，若后代具有父本特异条带，则能肯定杂交后代是真杂种，若不具有父本特异条带，则不能立即判定其为假杂种，需要用其余引物继续鉴定。花费时间较多，成本较高。
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法。一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法，包括以下步骤Al，基因组DNA提取以待鉴定的柳枝稷植株幼叶或种子为材料，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA ;提取的DNA用O. 8%的琼脂糖凝胶电泳进行纯度的检测；将DNA样品置于_20°C冰箱保存；待开始实验时，将各个DNA样品取出一部分稀释至20ng/y L，放于4°C冰箱保存并使用；A2，SSR 分析利用筛选得到的柳枝稷EST-SSR标记引物primerl-F:5’ -AGTTTGAGCTTTGTGTTTTTG-3’，primerl-R:5’ -CAACAATTTGGTTTCAACAAG-3’ ；进行杂种鉴定；PCR反应扩增体系20 μ L DNA 2 μ L(20ng/ μ L)，2XTaqPCRMasterMix 10 μ L，上下游引物各 I μ L (10 μ mol/L)，灭菌水补齐 20 μ L ;EST-SSR PCR 反应程序为94°C预变性 5min ;94°C变性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸I. 5min，共35个循环;最后72°C延伸10min，4°C保存。电泳分离最后PCR扩增产物采用I. 8 %的MetaPhor琼脂糖凝胶进行电泳 分离，O. lmg/mL的溴化乙锭染色，120V电压在O. 5 X TBE缓冲液中电泳约I. 5h，电泳结束后凝胶在凝胶成像系统中照相并保存；或者用PCR扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺甲叉=19 1，7. 5mol/L尿素，1XTBE缓冲液)上用I XTBE缓冲液进行垂直电泳分离。首先在正极缓冲液中加入EB (终浓度0. 75μ8/πι1)，用300伏电压跑45分钟，然后点样，300伏电压跑2小时。电泳结束后凝胶在凝胶成像系统(Bio-rad)中照相并保存。A3，杂种鉴定在杂交后代的扩增产物中，若具有父本特异条带，则为真杂种，反之，则为假杂交种。本发明是一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法。利用EST序列设计引物，利用开发得到的多态性高，带型稳定且清晰的具有双亲互补型条带的SSR引物对柳枝稷杂交种的植株或种子DNA进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，具有父本特异性条带的杂交种即为真杂交种，反之则为假杂交种。本方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，可以用于快速鉴定柳枝稷不同亲本组合的杂交种真实性。图I为杂交后代的SRAP分析；图2为引物I对柳枝稷杂交种的SSR检测图谱；图中A代表父本，D代表母本，其余条带为待鉴定的子代扩增的条带。本发明设计筛选的SSR引物可以在亲本中扩增出四条不同的特异条带，可以快速鉴定子代的杂种真实性。
进行杂种鉴定。该序列具有扩增条带清晰、带型稳定的特征，且能够在亲本中扩增出四条不同的特异条带。PCR反应扩增体系20 yL :DNA 2 μ L(20ng/μ L)，2XTaqPCRMasterMix (天根公司)10 μ L,上下游引物各I μ L(10 μ mol/L)，灭菌水补齐20 μ L。EST-SSR PCR 反应程序为94°C预变性 5min ;94°C变性 lmin，52°C退火 lmin，72°C延伸I. 5min，共35个循环；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。最后PCR扩增产物采用1.8%的MetaPhor琼脂糖凝胶进行电泳分离，O. lmg/mL的溴化乙锭染色，120V电压在O. 5 X TBE缓冲液中电泳约I. 5h，电泳结束后凝胶在凝胶成像系统中照相并保存；或者用PCR扩增产物在6%的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺甲叉=19 l，7.5m0l/L尿素，lXTBE缓冲液)上用I X TBE缓冲液进行垂直电泳分离。首先在正极缓冲液中加入EB (终浓度0. 75 μ g/ml)，用300伏电压跑45分钟，然后点样，300伏电压跑2小时。电泳结束后凝胶在凝胶成像系统(Bio-rad)中照相并保存。I. 2. 4杂种鉴定在杂交后代的扩增产物中，若具有父本特异条带，则为真杂种，反之，则为假杂交种，见图2。在图2中，该引物可以在亲本(A为父本，D为母本)中扩增出四条不同的特异条带，在子代中，若可以扩增出父本特异条带，则为真杂种，反之，为假杂种。图2中所示子代均具有父本特异条带。本发明的技术方案可以快速且准确地鉴定柳枝稷杂交种的真实性，节约成本同时节省时间。在鉴定过程中，若杂交后代不具有父本特异条带，则可以判定为假杂交种，不需要利用其余引物继续鉴定，相比SRAP标记技术，更加简便快捷，且准确性更高。应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。


本发明公开了一种利用SSR分子标记技术快速鉴定柳枝稷杂交种的方法，包括以下步骤A1，基因组DNA提取；A2，SSR分析；A3，杂种鉴定。利用EST序列设计引物，利用开发得到的多态性高，带型稳定且清晰的具有双亲互补型条带的SSR引物对柳枝稷杂交种的植株或种子DNA进行PCR扩增，使用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，具有父本特异性条带的杂交种即为真杂交种。本方法操作简便，费用低，准确度高且通用性好，可以用于快速鉴定柳枝稷不同亲本组合的杂交种真实性。