专利名称:一种山羊口疮病毒毒力弱化方法图1为未接种羊口疮病毒细胞系细胞图; 图2为接种4 后病变,细胞变圆,脱落图; 图3为接种后大量细胞变圆,出现空斑图。五本发明为一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法,包括以下步骤1)羊口疮病毒的分离与初步培养;2)羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化。羊口疮病毒的初步培养采用犊牛睾丸细胞系培养,犊牛睾丸细胞系的培养液为M199、DMEM (高糖)、 RPMI-1640培养基。(此三类培养基皆可以用于犊牛睾丸细胞系的培养。完全培养基含10% 的犊牛血清,犊牛睾丸细胞系在37°C,5%0)2培养2 3天可以用于接种病毒。羊口疮病毒分离于患病山羊的口唇部结痂。犊牛睾丸细胞系是通过导入端粒酶逆转录基因(hTERT)方法制备的。羊口疮病毒连续传代到85代以后直到毒力弱化。以下实施例用于说明本发明,但不限制本发明的使用范围(参见图1-3)。1、山羊口疮病毒的分离与初步培养采集患病奶山羊的口唇结痂,加入8 IOml的无菌PBS缓冲液进行浸泡,同时加入3 5倍正常用量的青链霉素。M 3 后研磨,把悬浊液置于4°C过夜。第二天取出悬浊液 4000rpm,离心lOmin,取上清液0. 22 m滤膜过滤除菌,300 L 500 L接种犊牛睾丸细胞系,连续盲传5代后,再接种犊牛睾丸细胞系后的48h、%h可观察到细胞病变。2、羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化当细胞病变达到809Γ90%后或细胞变圆,-20°C冰冻细胞培养液Mh以上,反复冻融3 次,然后无菌收集细胞培养物。同时以此代病毒接种细胞系,进行病毒传代,病毒传代到第 85代,细胞产生病变变慢(7 10天)。利用此羊口疮病毒对山羊进行口唇划痕接种,观察产生病变情况,此病毒的接种组产生了明显轻于强毒株的病变,并且口唇部病变的持续时间短于强毒株(参见表1)表1为羊口疮病毒毒力弱化效果测定,即此细胞系可以用于羊口疮病毒弱毒制备。本发明涉及一种山羊传染性脓疱病毒毒力弱化方法,其利用犊牛睾丸细胞系,通过羊口疮病毒的连续传代培养,致使羊口疮病毒毒力致弱,为羊口疮病毒弱毒疫苗的制备与生产提供了稳定可靠的方法,用以获得大量的稳定的疫苗。本发明包括以下步骤1)羊口疮病毒的分离与初步培养;2)羊口疮病毒在犊牛睾丸细胞系连续传代培养直到毒力弱化。步骤1)中,羊口疮病毒的初步培养采用犊牛睾丸细胞系培养,犊牛睾丸细胞系的培养液为M199、DMEM(高糖)、RPMI-1640培养基。步骤1)中,羊传染性脓疱病毒分离于患病山羊的口唇部结痂。步骤2)中,犊牛睾丸细胞系是通过导入端粒酶逆转录基因(hTERT)方法制备的。
一种山羊口疮病毒毒力弱化方法
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