专利名称：一种生长因子缓释微球及其制备方法生长因子(growth factor, GF)是刺激细胞生长和增殖的细胞外多肽信号分子。 通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合，调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽 类物质。生长因子存在于血小板和各种成体与胚胎组织及大多数培养细胞中，对不同种类 细胞具有一定的专一性，如神经生长因子、上皮生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细 胞生长因子等。神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，由效应神经元支配的靶组织细 胞合成和分泌，是具有神经元营养和促突起生长双重生物学功能的一种神经细胞生长调节 因子。神经生长因子被神经元轴突摄取后逆行运输至胞体，通过多种途径调节神经细胞的 基因转录，发挥生物效应，维持神经元的存活，刺激轴突的生长，对外周神经的发育和营养 起重要作用；还可以促进受损神经纤维修复，淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞增殖、分化， 伤口愈合等，对正常骨组织的神经维持亦有重要作用。目前神经生长因子可用于脑、脊髓损 伤、脊髓移植、骨科四肢神经损伤、坐骨神经损伤、多发性神经炎、椎间盘痛、神经断裂及退 行性病变。国外学者Eppley在应用神经生长因子修复兔下颂神经缺损的实验时，不仅证实 神经生长因子能促进神经轴突的再生，而且发现在再生轴突周围有新生类骨质形成。有研 究表明在骨折区局部应用神经生长因子可促进骨折愈合，骨痂生成量增多，骨痂刚度和抗 折弯强度显著增加，表明神经生长因子对成骨过程中的矿化过程有直接影响。在治疗周围神经损伤及骨折愈合过程中，很多学者探索了各种不同的给药方式， 如直接肌肉注射或静脉注射、通过肌肉周围的血管进行吸收、将神经生长因子注射于损伤 神经和骨折区域的局部或者将神经生长因子注入周围神经缺损桥接管内，具有一定效果。 目前的注射用鼠神经生长因子药物金路捷，恩经复，苏肽生都是肌肉注射，成品含5 %甘露 醇和0. 人血蛋白作保护剂。但在实际应用中，由于神经生长因子活性半衰期较短，在水 溶液中易失活，且易受湿度、酸碱度等多种因素的影响，在神经再生及骨折愈合的整个漫长 过程中，神经生长因子不能长时间持续发挥促再生作用，全身应用被快速灭活，局部穿刺分 次给药又无法保证每次释药部位的准确性，因此限制了其临床应用。制备神经生长因子缓 释制剂是解决上述问题的有效途径。现阶段，骨折和骨缺损的修复机制已经初步探明，但适用于骨缺损修复的神经生 长因子局部用药缓释剂型尚未见报道。因此，提供一种能够长时间持续发挥作用的生长因 子缓释微球及其制剂用于制备治疗骨损伤的药物具有现实意义。
有鉴于此，本发明提供一种生长因子缓释微球及其凝胶制剂和制备方法。本发明 采用单甲氧基聚乙二醇聚乳酸包封神经生长因子后制成生长因子缓释微球，可以控制药物以一定的速度释放，延长药物的生理活性，提高药物的稳定性和靶向性；将聚氧乙烯聚氧丙 烯醚加入到生长因子缓释微球中制得的生长因子缓释微球制剂具有粘附性能好的优点，不 易在骨创伤组织脱落和挥发，有效发挥药理活性。本发明提供了一种生长因子缓释微球，包含神经生长因子、重均分子量为10-10. 5 万的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸、助溶剂、乳化剂和稳定剂，神经生长因子和单甲氧基聚乙 二醇聚乳酸的质量比为0.8-1. 2 2. 4-3. 6X104，所述生长因子缓释微球的平均粒径为 52. 9-95. 5 μ m。高分子微球包裹技术在医药领域缓释制剂中具有广泛运用，以高分子为载体的缓 释微球不但可以控制药物以一定的速度释放，而且可以通过合适的释药途径延长药物的生 理活性，提高药物的稳定性，而且具有一定的靶向性，从而使药物的药理活性达到较理想的 效果。本发明中采用的高分子包埋材料单甲氧基聚乙二醇聚乳酸，由不同分子量聚乙二醇 与聚乳酸按一定比例通过开环共聚得到，为无定型聚合物，共聚物具有更大的亲水性，可用 于药物缓释载体和组织工程细胞培养支架，在医药界已经得到广泛的应用，具有组织相容 性好，对人体安全无害等特点。神经生长因子通过采用单甲氧基聚乙二醇聚乳酸包封后制 成的缓释微球具有长时间缓释特点。聚乙二醇(polyethyleneg lycol，PEG)是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合 而得到的一类分子量较低的水溶性聚醚。聚乙二醇同系物的化学性质比较稳定，无臭或味 微臭无毒，具有吸湿性，绝大多数都易溶于水，可溶于乙醇、丙酮、氯仿等多数有机溶剂，通 常情况下不活泼、不水解、耐热，可用热压灭菌。在室温条件下，分子量在100以下的聚乙二 醇通常为无色或几乎无色的透明澄清粘稠液体，分子量在2000以上的为固体。聚乙二醇水 溶液呈微酸性或中性，其分子链上两端的羟基都具有反应活性，能发生所有脂肪族羟基所 能进行的化学反应。聚乙二醇目前应用极为广泛，它可应用于医药、卫生、食品、化工等综合 领域，具有以下优点首先聚乙二醇(PEG)是无毒和非免疫原性亲水聚合物，具有良好的生 物相容性；其次，聚乙二醇是种两亲性物质，既可以溶解于水，又可以溶解于绝大多数的有 机溶剂，聚乙二醇具有化学惰性，对绝大多数化学反应稳定，但在其羟基活化后又易于跟含 有氨基的化合物进行键合，把许多优良性质转移到结合物中；除此以外，聚乙二醇具有一系 列连续的分子量(1000-500000)，其价格相对低廉，适宜规模化生产。聚乳酸(PLA)对人体无毒无害，是经美国FDA批准用作医用手术缝合线和注射用 微囊、微球、埋植剂等制剂的材料，具有良好的生物可降解性，使用后能被自然界中微生物 完全降解，最终生成二氧化碳和水，不污染环境，是公认的环境友好材料。单甲氧基聚乙二醇聚乳酸由不同分子量聚乙二醇与聚乳酸按一定比例通过开环 共聚得到，为无定型聚合物，玻璃化转变温度为40-55°C，粘度IV(dl/g)范围0. 10-1.0。单 甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物比聚乳酸具有更大的亲水性，可用于药物缓释载体和组织工 程细胞培养支架。 作为优选，所述所述单甲氧基聚乙二醇聚乳酸中，聚乙二醇分子量为5000，聚乙二 醇和聚乳酸的聚合比例为1 80-120。作为优选，助溶剂选自磷酸盐缓冲液。优选地，磷酸盐缓冲溶液的pH值为7. 1-7. 3。作为优选，乳化剂选自二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、二氧六环、丙酮、四氢呋喃、冰醋酸1苯1甲苯中的一种或两者以上的混合物。[oo15] 优选地，所述助溶剂包含体积比为2—4l的二氯甲烷和丙酮混合溶剂。[oo16] 优选地，所述稳定剂包含重均分子量为4—6万的海藻酸钠。[oo17] 海藻酸钠，一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性1溶解性1粘性和安全性。分子式为(C。H，。。Na)n，主要由海藻酸的钠盐组成，由a—L一甘露糖醛酸(M单元)与b—D一古罗糖醛酸(G单元)依靠l，4一糖苷键连接并由不同GG(；-MMM片段组成的共聚物。[oo18] 本发明还提供了一种所述生长因子缓释微球的制备方法，包括以下步骤[oo19] 步骤l将o．8一1．2份的神经生长因子溶于8．o×lo‘一1．2×lo‘份的磷酸盐缓沖液中，制成浓度为6．7×lo—1．5×lo一3％的水相溶液； 步骤2将2．4—3．6×lo‘份的重均分子量为lo—lo．5万的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸溶于8．o×105一1．2×lo‘份的体积比为2—4l的二氯甲烷和丙酮混合溶剂中，冰浴超声分散o．8一1．2min，制成浓度为2—4．5％的油相溶液； 步骤3将所述水相溶液和所述油相溶液制备成油包水型乳液，将4．o×lo‘份重均分子量为4—6万的海藻酸钠溶于剩余重量份的份磷酸缓沖液，与所述油包水型乳液混合后冰浴超声分散o．8一1．2min，制成微乳液； 步骤4将所述微乳液在室温下低速搅拌3—5min，自然挥发或抽提出去二氯甲烷，制得所述神经生长因子缓释微球。 本发明还提供了上述制备方法制得的生长因子缓释微球。 本发明还提供了所述生长因子缓释微球在制备治疗骨损伤药物中的应用。
本发明还提供了一种生长因子缓释微球制剂，包括所述的生长因子缓释微球以及药学上可接受的辅料。
作为优选，所述药学上可接受的辅料为聚氧乙烯聚氧丙烯醚。
聚氧乙烯聚氧丙烯醚(泊洛沙姆)是一种高分子非离子型表面活性剂，为美国国家处方集新增加的药物辅助材料，具有在低温下(4—5℃)为液体，体温下为凝胶的独特性质。凝胶具有黏附性能好，不易在骨创伤组织脱落和挥发的优点。本发明提供的神经生长因子缓释微球制剂在4—5℃为可流动的胶体，20一38℃为凝胶。
磷酸盐缓沖液3．208—4．812×lo‘份
聚氧乙烯聚氧丙烯醚6．o一9．o×lo‘重量份
%。微球在14d内，不仅一直持续释放神经生长因子，而且所释 放出的神经生长因子浓度可以保持在一定的水平(54. 67-76.81)fmol/yL，平均浓度为 (65.74±11.07)fmol/yL。经检测表明，本发明提供的生长因子缓释微球的突释期仅为 18. 37%，14d后释放度达75. 72%。以累积释放率和时间进行拟合，神经生长因子缓释微 球的体外释药规律符合 Higuichi 方程=Q = 27. 7636t1/2-13. 4247，r = 09975 (η = 3)。生 长因子缓释微球的体外释药曲线也显示本发明提供的生长因子缓释微球体外能够持续释 药，具有明显的缓释作用，可以控制药物以一定的速度释放，延长药物的生理活性，提高药 物的稳定性和靶向性；将聚氧乙烯聚氧丙烯醚加入到生长因子缓释微球中制得的生长因子 缓释微球制剂具有粘附性能好的优点，不易在骨创伤组织脱落和挥发，有效发挥药理活性。 骨损伤动物试验结果表明，在试验动物伤后7天，各试验组疗效与对照组相似，但好于空白 组。伤后14天，实验组和对照组显著好于空白组(P < 0. 05)，且因药物的缓释效应，试验组 疗效好于对照组。伤后28天，试验组显著要好于对照组(金路捷)和空白组(生理盐水) (P < 0. 05)。综合上述试验结果，生长因子缓释微球及其制剂对骨损伤有较好的治疗效果。


图1示生长因子缓释微球扫描电镜图，放大倍数为500倍。图2示生长因子缓释微球粒径分布图。图3示生长因子体外释药曲线。

神经生长因子缓释微球所含药物重
载药量=χ 100%
神经生长因子缓释微球的总重包封率公式为


本发明公开了一种生长因子缓释微球，包含神经生长因子、重均分子量为10-10.5万的单甲氧基聚乙二醇聚乳酸、助溶剂、乳化剂和稳定剂，神经生长因子和单甲氧基聚乙二醇聚乳酸的质量比为0.8-1.2∶2.4-3.6×104，缓释微球的平均粒径为52.9-95.5μm。本发明还提供了一种生长因子缓释微球制剂，包含上述生长因子缓释微球及6.0-9.0×103重量份的聚氧乙烯聚氧丙烯醚。骨损伤动物试验结果表明，生长因子缓释微球及其制剂对骨损伤有较好的治疗效果，显著优于对照组和空白组P＜0.05。