专利名称：极端嗜盐绿色杜氏藻培养方法 极端嗜盐卤水环境下(盐度大于15°Be’)生长的绿色杜氏藻具有独特的生物特性，藻体内含有多种生物活性物质。可应用于人体保健、生物制药、基因工程等领域，开发天然保健品或生物药品以及耐盐基因应用研究，具有一定的应用价值，应用前景广阔。经检索目前对于盐生杜氏藻(Dunaliella.salina)的研究主要涉及分析杜氏藻属嗜盐种间遗传多样性、盐生杜氏藻的培养技术与应用、杜氏藻对盐度的生理反应等方面，均没有涉及极端嗜盐绿色杜氏藻(Dunaliella.viridis)培养技术的研究。
本发明的目的是填补现有技术存在的空白，提供一种极端嗜盐绿色杜氏藻培养方法。本发明极端嗜盐绿色杜氏藻培养方法，包括以下步骤(1)培养液的制备，所述培养液的制备包括下述步骤①取含盐量为15～25°Be’的卤水；②向上述卤水中添加营养盐NaH2PO410g/m3以及CH4N2O即尿素110g/m3；③调节上述溶液使其PH值为6～8；④使用浓度为1ppm二氧化氯消毒剂对上述溶液进行杀菌除藻处理；(2)藻种的制备，所述藻种的制备包括下述步骤①取含盐量为25～27°Be’卤水；②向上述卤水中添加卤虫干粉0.8～1.2g/L；③将上述溶液放置在光照培养箱中培养，培养条件为光照10000～15000LX，温度30～40℃，培养1～2周；④使用水滴分离法从上述溶液中分离藻种；⑤将分离得到的藻种转移到盐度为15～25°Be’并已添加营养盐的无菌卤水培养液中，在上述培养条件下培养2～3周得到藻种悬浮液；(3)提高上述藻种悬浮液的盐度，使含盐量达到20～25°Be’，在光照2300～2600LX，温度18～22℃的条件下进行藻种的保种；(4)在培养液中按照8×103cells/ml～12×103cells/ml密度接种藻种； (5)在光照、温度为20～35℃、培养液的PH值为6～8的条件下进行培养，向培养液每7～10天投放一次营养盐NaH2PO410g/m3以及CH4N2O110g/m3。所述的步骤(4)的最佳接种密度为10×103cells/ml。所述的步骤(5)的最佳温度为25～30℃。本发明极端嗜盐绿色杜氏藻培养方法为大面积产业化养殖该藻类提供了必要的技术途径，为应用开发该藻类提供了可能。极端嗜盐绿色杜氏藻具有研究、开发的价值。
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例11.制备培养液从长芦盐区盐场高级制卤区买来盐度为15°Be’的卤水100升，首先使用脱脂棉滤去脏物；然后添加营养盐NaH2PO41克以及尿素即CH4N2O 11克；而后测试PH值，如果PH值在6～8这个范围，无需调节，如果超出这个范围，使用稀10％HCl或10％NaOH调节PH值为6～8；最后使用市场销售的二氧化氯消毒剂(CLO2含量为2％)5克对卤水进行杀菌除藻处理，即制得培养液。放置48小时后接种使用。
2.藻种制备自中国渤海湾滩涂长芦盐区盐场高级制卤区取来盐度为25°Be’的卤水1升。首先是预培养，向卤水中添加的卤虫干粉1克，而后使用锥形瓶在光照培养箱中培养，培养条件为光照10000LX，温度40℃；培养1周，镜检发现绿色杜氏藻发生后，使用水滴分离法分离藻种，将分离得到的藻种迅速转移到盐度为15°Be’并已添加营养盐的无菌卤水培养液中，按照上述培养条件培养2周可制得藻种悬浮液。
3.藻种保种将培养液盐度逐渐提高到20°Be’，培养条件调控为光照2500LX，温度20℃。
4.接种接种前，使用血球计数板法测试藻种悬浮液密度，根据藻种密度和接种培养液体积，按照1×104cells/ml密度接种藻种。测得藻种悬浮液密度为200×104cells/ml，取放置48小时后的培养液100升，投放藻种悬浮液500ml；5.调控培养环境将上述接种后的100升培养液PH值控制在6～8之间，投放营养盐NaH2PO41克以及尿素11克，每7天添加一次；在室温25℃、室内普通日光灯照射条件下培养，培养12天，水体中极端嗜盐绿色杜氏藻即可大量发生。
实施例21.制备培养液从长芦盐区盐场高级制卤区买来盐度为18°Be’的卤水100升，首先使用脱脂棉滤去脏物；然后添加营养盐NaH2PO41克以及尿素即CH4N2O 11克；而后测试PH值，如果PH值在6～8这个范围，无需调节，如果超出这个范围，使用稀10％HCl或10％NaOH调节PH值为6～8；最后使用市场销售的二氧化氯消毒剂(CLO2含量为2％)5克对卤水进行杀菌除藻处理，即制得培养液。放置48小时后接种使用。
2.藻种制备自中国渤海湾滩涂长芦盐区盐场高级制卤区取来盐度为26％的卤水1升。首先是预培养，向卤水中添加卤虫干粉0.8克，而后使用锥形瓶在光照培养箱中培养，培养条件为光照12000LX，温度40℃；培养1.5周，镜检发现绿色杜氏藻发生后，使用水滴分离法分离藻种，将分离得到的藻种迅速转移到盐度为18°Be’并已添加营养盐的无菌卤水培养液中，按照上述培养条件培养2～3周可制得藻种悬浮液。
3.藻种保种将培养液盐度逐渐提高到22°Be’，培养条件调控为光照2300LX，温度18℃。
4.接种接种前，使用血球计数板法测试藻种悬浮液密度，根据藻种密度和接种培养液体积，按照8×103cells/ml密度接种藻种。测得藻种悬浮液密度为160×104cells/ml，取放置48小时的培养液100升，投放藻种悬浮液500ml；5.调控培养环境将上述接种后的100升培养液PH值控制在6～8之间，投放营养盐NaH2PO41克以及尿素11克，每9天添加一次；在室温20℃、室内普通日光灯照射条件下培养，培养13天，水体中极端嗜盐绿色杜氏藻即可大量发生。
实施例31.制备培养液从长芦盐区盐场高级制卤区买来盐度为22°Be’的卤水100升，首先使用脱脂棉滤去脏物；然后添加营养盐NaH2PO41克以及尿素即CH4N2O 11克；而后测试PH值，如果PH值在6～8这个范围，无需调节，如果超出这个范围，使用稀10％HCl或10％NaOH调节PH值为6～8；最后使用市场销售的二氧化氯消毒剂(CLO2含量为2％)5克对卤水进行杀菌除藻处理，即制得培养液。放置48小时后接种使用。
2.藻种制备自中国渤海湾滩涂长芦盐区盐场高级制卤区取来盐度为26°Be’的卤水1升。首先是预培养，向卤水中添加卤虫干粉1.2克，而后使用锥形瓶在光照培养箱中培养，培养条件为光照15000LX，温度30℃；培养2周，镜检发现绿色杜氏藻发生后，使用水滴分离法分离藻种，将分离得到的藻种迅速转移到盐度为22°Be’并已添加营养盐的无菌卤水培养液中，按照上述培养条件培养3周可制得藻种悬浮液。
3.藻种保种将培养液盐度逐渐提高到25°Be’，培养条件调控为光照2600LX，温度22℃。
4.接种接种前，使用血球计数板法测试藻种悬浮液密度，根据藻种密度和接种培养液体积，按照1.2×104cells/ml密度接种藻种。测得藻种悬浮液密度为240×104cells/ml，取放置48小时的培养液100升，投放藻种悬浮液500ml；5.调控培养环境将上述接种后的100升培养液PH值控制在6～8之间，投放营养盐NaH2PO41克以及尿素11克，每10天添加一次；在室温20℃、室内普通日光灯照射条件下培养，培养15天，水体中极端嗜盐绿色杜氏藻即可大量发生。
实施例41.制备培养液从长芦盐区盐场高级制卤区买来盐度为25°Be’的卤水100升，首先使用脱脂棉滤去脏物；然后添加营养盐NaH2PO41克以及尿素即CH4N2O 11克；而后测试PH值，如果PH值在6～8这个范围，无需调节，如果超出这个范围，使用稀10％HCl或10％NaOH调节PH值为6～8；最后使用市场销售的二氧化氯消毒剂(CLO2含量为2％)5克对卤水进行杀菌除藻处理，即制得培养液。放置48小时后接种使用。
2.藻种制备自中国渤海湾滩涂长芦盐区盐场高级制卤区取来盐度为27°Be’的卤水1升。首先是预培养，向卤水中添加卤虫干粉1克，而后使用锥形瓶在光照培养箱中培养，培养条件为光照10000LX，温度40℃；培养1周，镜检发现绿色杜氏藻发生后，使用水滴分离法分离藻种，将分离得到的藻种迅速转移到盐度为25°Be’并已添加营养盐的无菌卤水培养液中，按照上述培养条件培养3周可制得藻种悬浮液。
3.藻种保种将培养液盐度控制在25°Be’，培养条件调控为光照2300LX，温度18℃。
4.接种接种前，使用血球计数板法测试藻种悬浮液密度，根据藻种密度和接种培养液体积，按照1×104cells/ml密度接种藻种。测得藻种悬浮液密度为200×104cells/ml，取放置48小时后的培养液100升，投放藻种悬浮液500ml；5.调控培养环境将上述接种后的100升培养液PH值控制在6～8之间，投放营养盐NaH2PO41克以及尿素11克，每7天添加一次；在室温26℃、室外自然太阳光照射条件下培养，培养15天，水体中极端嗜盐绿色杜氏藻即可大量发生。
极端嗜盐绿色杜氏藻的耐盐基因是目前植物界中发现的耐盐性最好的基因，可以提取，应用于基因工程领域；极端嗜盐环境下生长的杜氏藻细胞体内甘油成分高达60％以上，利用极端嗜盐绿色杜氏藻合成天然植物甘油的能力可生产天然植物甘油；极端嗜盐绿色杜氏藻细胞体内含有植物蛋白、叶绿素、甘油及其他种类生物活性物质，可应用于人体保健、生物制药等领域，开发天然保健品或生物药品。


本发明公开了一种极端嗜盐绿色杜氏藻培养方法，包括下述步骤(1)培养液的制备，同时对盐度、pH值调，进行消毒和除藻处理；(2)制备藻种；(3)接种，在培养液中按照8×10