一种具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架及其制备方法[0002]20世纪90年代，美国学者Vacant和Langer提出组织工程的再生医学概念，现在逐渐形成了组织工程学这门新学科。组织工程学是利用生命科学与工程学的原理和方法，研究和开发具有修复或改善人体组织或器官功能的新一代临床应用替代物，用于替代组织或器官的部分或全部功能。组织工程的发展也为软骨损伤的修复提供了另外一条途径，尤其在解决移植组织来源的问题上，结合细胞因子与组织工程支架，能够减少对移植组织、细胞的过多依赖，简化手术操作技术，改善修复效果。[0003]关节软骨可分为浅表层、过渡层、辐射层以及钙化软骨层。关节软骨分层排列反映了与关节软骨功能相适应的生物力学变化。浅表层主要以剪力为主，过渡区和辐射区则主要承受压力载荷，钙化软骨层将关节面附着于骨上。浅表层包含10-20%的软骨组织，由梭形软骨细胞和微细胶原构成。。该层又分为细胞层和无细胞层，无细胞层即亮板层。位于最表层，无细胞，构成关节软骨的连接面，含有蛋白多糖丝状体；而细胞层则由扁平的细胞和包绕细胞的微细胶原所构成。过渡层:或叫中间层，包含了 40-60%的软骨组织，该层软骨细胞呈球形，胶原纤维呈斜行排列。幅射层:其细胞大、圆、并垂直于表面，呈柱状排列，其胶原纤维在细胞之间呈放射状排列。钙化层:紧贴软骨下骨板，本层细胞有死亡细胞所有的特征，钙化层与软骨下骨板表面之间有交叉现象，该层最深而分隔出有血管的软骨下骨和无血管的关节软骨。[0004]采用组织工程学方法构建骨软骨复合组织时间并不长，作为理想的骨软骨组织工程，应包含一个具有一定力学性能的三维多孔支架，同时在支架的上部结合具有促进软骨细胞生长的支架，采用这种骨软骨支架的方式来进行骨软骨的组织工程或体内修复。[0005]层区软骨组织工程支架需满足以下条件:1)支架各层的力学性能不同；2)支架各层的孔径和孔隙率不同；3)支架各层的降解性能不同；4)支架各层的生物相容性问题。[0006]大量研究表明，按照软骨的层区结构设计用于骨软骨一体化修复的效果要优于单纯的对软骨的修复。通过比较可以发现，现有的用于骨软骨一体化组织工程支架的设计主要集中在支架的机械强度和支架的功能性没有得到兼顾，所以设计出的一体化修复支架有许多问题有待于解决。
[0007]为了克服现有技术的上述缺点与不足，本发明的目的在于提供一种具有规则互穿网络结构的骨软骨三 维支架，在机械强度和内部结构上都满足软骨修复的要求，并且实现了支架各层区所需的功能化要求。[0008]本发明的另一目的在于提供上述骨软骨三维支架的制备方法。
[0009]本发明的目的通过以下技术方案实现:
[0010]一种具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架，由生物医用高分子材料体系和原位生成水凝胶材料体系形成规则的互穿网络结构；
[0011] 所述生物医用高分子材料体系由生物医用高分子材料和无机材料组成；所述生物医用高分子材料为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚己内酯、聚氨酯和聚羟基丁酸酯中的至少一种；所述无机材料为羟基磷灰石、磷酸三钙、生物玻璃、硅酸钙、二氧化硅、石墨烯中的至少一种；
[0012]所述原位生成水凝胶材料体系由原位水凝胶材料和给药系统组成。
[0013]所述原位水凝胶材料为温度响应水凝胶、光响应水凝胶、pH响应水凝胶、压力响应水凝胶、电磁响应水凝胶中的至少一种。
[0014]所述给药系统为生物活性分子或载药微球或载药脂质体或载药微囊中的至少一种。
[0015]所述骨软骨三维支架包括钙化层、放射层、过渡层和浅表层，各层之间相互连通；
[0016]所述钙化层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为95%_85%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为5%-15% ;所述钙化层的生物医用高分子材料体系中，无机物的质量百分数为30%-95%，生物医用高分子材料的质量百分数为70%-5% ；
[0017]所述放射层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为90%_70%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为10%-30% ;所述放射层的生物医用高分子材料体系中，无机物的质量百分数为5%-50%，生物医用高分子材料的质量百分数为95%-50% ；
[0018]所述过渡层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为85%_40%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为15%-60% ;所述过渡层的生物医用高分子材料体系中，无机物的质量百分数为0%-10%，生物医用高分子材料的质量百分数为100%-90% ；
[0019]所述浅表层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为70%_20%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为30%-80% ;所述浅表层的生物医用高分子材料体系中，无机物的质量百分数为0%-5%，生物医用高分子材料的质量百分数为100%-95%。
[0020]所述钙化层的厚度为100-1500 μ m，放射层厚度为1000-3000 μ m，过渡层厚度为500-2000 μ m,浅表层厚度为 100-3000 μ m。
[0021]所述钙化层的孔隙率为30%_60%，放射层的孔隙率为40%_70%，过渡层的孔隙率为50%-85%，浅表层的孔隙率为60%-95%。
[0022]所述钙化层的孔径为50-500 μ m，放射层孔径为50-500 μ m，过渡层的孔径为20-800 μ m,浅表层孔径为20-800 μ m。
[0023]上述的骨软骨三维支架的制备方法，通过3D打印技术实现具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架的制备。
[0024]通过3D打印技术制备具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架的过程具体为:
[0025]按照钙化层、放射层、过渡层和浅表层的机械强度和细胞生长环境要求选择生物医用高分子材料和支架内部孔径孔隙率，将选取的各层的生物医用高分子材料置于不同料斗中，设置每个料筒的参数；按照软骨不同层区功能要求，选取各层的原位生成水凝胶材料置于不同料斗中，设置每个料斗的参数。设计互穿网络结构，设计不同材料体系运行顺序，设置仪器参数后，运行程序。
[0026]与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果:
[0027](I)本发明的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架，是一种新型的骨软骨一体化组织工程支架，该支架中生物医用高分子材料体系主要使支架所必须的满足骨软骨机械性能和细胞生长环境要求得到满足；而水凝胶体系在支架中作为生物活性分子或其他给药系统的载体，实现了各层区的功能化要求。
[0028](2)本发明通过对三维支架各层区的梯度设计，满足软骨修复中各层区的机械性能和内部结构的要求，并通过设计各层区的功能化载体满足软骨修复中各层区的功能性要求。该支架兼顾了机械性能、细胞生长环境和各层区的功能要求且这些性质可以通过改变材料体系、过程参数、功能化载体的设计、生物活性分子的选择上实现较大的调控范围。


[0029]图1为本发明的实施例1的骨软骨三维支架整体结构示意图。
[0030]图2为本发明的实施例1得到的骨软骨三维支架的剖面图。
[0031]图3为本发明的实施例2的骨软骨三维支架的过渡层的电子扫描显微镜图片。
[0032]图4为本发明的实施例2中的骨软骨三维支架的位移-载荷图。

[0033]下面结合实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0034]实施例1
[0035]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架:由生物医用高分子材料体系和原位生成水凝胶材料体系形成规则的互穿网络结构，包括钙化层、放射层、过渡层和浅表层，各层之间相互连通，内部孔洞位方形。钙化层的厚度为100μπι，放射层的厚度为1000 μ m,过渡层的厚度为500 μ m,浅表层的厚度为100 μ m。钙化层和放射层的孔径为50 μ m,过渡层和浅表层和孔径为20 μ m。
[0036]其中，生物医用高分子材料体系由聚氨酯和羟基磷灰石组成，在钙化层的生物医用高分子材料体系中聚氨酯含量为70wt%，羟基磷灰石的含量为30wt% ;在放射层生物医用高分子材料体系中聚氨酯的含量为95wt%，羟基磷灰石的含量为5wt% ;在过渡层生物医用高分子材料体系中聚氨酯含量为100wt%，羟基磷灰石的含量为0wt% ;在浅表层生物医用高分子材料体系中聚氨酯含量为100wt%,羟基磷灰石的含量为0wt%。
[0037]原位生成水凝胶材料体系由混有TGF- β 3蛋白的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物形成的温敏性水凝胶组成。
[0038]所述钙化层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为90%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为10% ;放射层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为80%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为20% ;过渡层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为50%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为50% ;浅表层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为50%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为50%。
[0039]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架的制备方法如下:
[0040](1)3D打印机参数的设定:设定钙化层的厚度为100μπι，放射层的厚度为1000 μ m,过渡层的厚度为500 μ m,浅表层的厚度为100μπι。设定支架内部的孔洞结构为方形；设定钙化层和放射层的孔径为50 μ m,设定过渡层和浅表层和孔径为20 μ m,设定完毕上述参数后，支架各层的孔隙率大致确定。
[0041](2)将准备的材料分别放入不同的料斗中，设定适当的温度和压力后，运行程序后即可得到具有规则互穿网络结构的一体化骨软骨修复三维支架。
[0042]图1为本实施例得到的骨软骨三维支架的整体结构示意图，包括钙化层1、放射层
2、过渡层3和浅表层4。图2为本实施例得到的骨软骨三维支架的剖面图。图中实线代表生物医用高分子材料体系，虚线代表原位生成水凝胶材料体系。
[0043]实施例2
[0044]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架:由生物医用高分子材料体系和原位生成水凝胶材料体系形成规则的互穿网络结构，包括钙化层、放射层、过渡层和浅表层，各层之间相互连通，包括钙化层、放射层、过渡层和浅表层，各层之间相互连通，内部孔洞位 方形。钙化层的厚度为1500μπι，放射层的厚度为3000μπι，过渡层的厚度为2000 μ m,浅表层的厚度为3000 μ m。钙化层和放射层的孔径为500 μ m,设定过渡层和浅表层和孔径为800 μ m。
[0045]其中，生物医用高分子材料体系由聚乳酸和生物玻璃组成；钙化层的生物医用高分子材料体系中聚乳酸含量为5wt%，生物玻璃的含量为95wt% ;在放射层生物医用高分子材料体系中聚乳酸的含量为50wt%，生物玻璃的含量为50wt% ;在过渡层生物医用高分子材料体系中聚乳酸含量为90wt%，生物玻璃的含量为10wt% ;在浅表层生物医用高分子材料体系中聚乳酸含量为5wt%，生物玻璃的含量为95wt%。
[0046]原位生成水凝胶材料体系中的原位生成水凝胶材料为PDMAEMA (聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯)-g-PNIPAM)(聚N-异丙基丙烯酰胺)，具有温度和PH双重相应性。在钙化层和放射层的水凝胶材料中混有BMP-2蛋白，促进这两层的钙化和成骨；在过渡层和浅表层的水凝胶材料中混有TGF-β I蛋白，促进这两层成软骨化。
[0047]所述钙化层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为95%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为5% ;放射层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为85%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为15%;过渡层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为75%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为25% ;浅表层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为65%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为35%。
[0048]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架的制备方法如下:
[0049](I) 3D打印机参数的设定:设定钙化层的厚度为1500μπι，放射层的厚度为3000 μ m,过渡层的厚度为2000 μ m,浅表层的厚度为3000 μ m ;设定支架内部的孔洞结构为方形；设定钙化层和放射层的孔径为500 μ m，设定过渡层和浅表层和孔径为800 μ m。设定完毕上述参数后，支架各层的孔隙率大致确定。
[0050](2)将准备的材料分别放入不同的料斗中，设定适当的温度和压力后，运行程序后即可得到具有规则互穿网络结构的一体化骨软骨修复三维支架。
[0051]图3为本实施例的骨软骨三维支架的过渡层的电子扫描显微镜图片。由图可知所设计的骨软骨三维支架中纤维部分突出物为生物玻璃，支架中孔的连通和各层的粘结情况良好，易于细胞的粘附和增殖。[0052]图4为本实施例的骨软骨三维支架的位移-载荷图。本实施例的支架的尺寸为10*10*6mm，支架在受到压缩载荷时发生弹性形变，从图中可以看出设计的支架在形变量较小时，支架的弹性形变符合胡克定律，该支架在较大形变量时发生屈服。通过计算得到支架整体的压缩模量约为7MPa，满足骨软骨修复要求。
[0053]实施例3
[0054]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架:由生物医用高分子材料体系和原位生成水凝胶材料体系形成规则的互穿网络结构，包括钙化层、放射层、过渡层和浅表层，各层之间相互连通，内部孔洞位方形。钙化层的厚度为500 μ m，放射层的厚度为2000 μ m，过渡层的厚度为1500 μ m，浅表层的厚度为2500 μ m。设定支架内部的孔洞结构为方形；设定钙化层和放射层的孔径为450 μ m，设定过渡层和浅表层和孔径为200 μ m。
[0055]其中，生物医用高分子材料体系由聚己内酯和磷酸三钙组成；钙化层的生物医用高分子材料体系中聚己内酯含量为60wt%，磷酸三钙的含量为50wt% ;在放射层生物医用高分子材料体系中聚己内酯的含量为45wt%，磷酸三钙的含量为55wt% ;在过渡层生物医用高分子材料体系中聚己内酯含量为95wt%，磷酸三钙的含量为5wt% ;在浅表层生物医用高分子材料体系中聚己内酯含量为98wt%，磷酸三钙的含量为2wt%。
[0056]所述钙化层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为85%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为15% ;放射层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为85%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为15%;过渡层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为80%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为20% ;浅表层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为40%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为60%。
[0057]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架的制备方法如下:
[0058](1)3D打印机参数的设定:设定钙化层的厚度为500μπι，放射层的厚度为2000 μ m，过渡层的厚度为1500 μ m，浅表层的厚度为2500 μ m。设定支架内部的孔洞结构为方形；设定钙化层和放射层的孔径为450 μ m，设定过渡层和浅表层和孔径为200 μ m。设定完毕上述参数后，支架各层的孔隙率大致确定。
[0059](2)将准备的材料分别放入不同的料斗中，设定适当的温度和压力后，运行程序后即可得到具有规则互穿网络结构的一体化骨软骨修复三维支架。
[0060]实施例4
[0061]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架:由生物医用高分子材料体系和原位生成水凝胶材料体系形成规则的互穿网络结构，包括钙化层、放射层、过渡层和浅表层，各层之间相互连通，内部孔洞位方形。钙化层的厚度为800μπι，放射层的厚度为1500 μ m,过渡层的厚度为700 μ m,浅表层的厚度为1500 μ m。钙化层和放射层的孔径为350 μ m,设定过渡层和浅表层和孔径为550 μ m。
[0062]其中，生物医用高分子材料体系由PLGA和硅酸钙组成。钙化层的生物医用高分子材料体系中PLGA含量为65wt%，硅酸钙的含量为35wt% ;在放射层生物医用高分子材料体系中PLGA的含量为 35wt%，硅酸钙的含量为65wt% ;在过渡层生物医用高分子材料体系中PLGA含量为97wt%，硅酸钙的含量为3wt% ;在浅表层生物医用高分子材料体系中PLGA含量为96wt%,硅酸钙的含量为4wt%。
[0063]原位生成水凝胶材料体系中的原位生成水凝胶材料为N-异丙基丙烯酸酰胺温度响应性响应水凝胶，在钙化层和放射层的水凝胶材料中混有BMP-7蛋白，促进这两层的钙化和成骨；在过渡层和浅表层的水凝胶材料中混有TGF-β I蛋白，促进这两层成软骨化。
[0064]所述钙化层中，生物医用高分子材料体系的占质量百分比为90%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为10% ;放射层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为70%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为30% ;过渡层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为40%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为60% ;浅表层中，生物医用高分子材料体系的质量百分比为20%，原位生成水凝胶材料体系的质量百分比为80%。
[0065]本实施例的具有规则互穿网络结构的骨软骨三维支架的制备方法如下:
[0066](1)3D打印机参数的设定:设定钙化层的厚度为800μπι，放射层的厚度为1500 μ m，过渡层的厚度为700 μ m，浅表层的厚度为1500 μ m。设定支架内部的孔洞结构为方形；设定钙化层和放射层的孔径为350 μ m,设定过渡层和浅表层和孔径为550 μ m。设定完毕上述参数后，支架各层的孔隙率大致确定。
[0067](2)将准备的材料分别放入不同的料斗中，设定适当的温度和压力后，运行程序后即可得到具有规则互穿网络结构的一体化骨软骨修复三维支架。
[0068]原位生成水凝胶材料体系中的原位生成水凝胶材料为聚丙烯酰胺pH响应水凝胶，在钙化层和放射层的水凝胶材料中混有BMP-2蛋白，促进这两层的钙化和成骨；在过渡层和浅表层的水凝胶材料中混有IGF-1蛋白，促进这两层成软骨化。
[0069]上述实施例中，生物医用高分子材料温度响应水凝胶、光响应水凝胶、pH响应水凝胶、压力响应水凝胶、电磁响应水凝胶中的至少一种；给药系统为生物活性分子或载药微球或载药脂质体或载药微囊至少一种。
[0070]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。