一种软骨组织工程支架及其制备方法[0002]软骨组织工程是一种采用组织工程学方法构建软骨复合组织的技术。软骨组织工程中三大基本要素是:种子细胞，可降解的软骨组织工程支架以及细胞生长调节因子，其中，软骨组织工程支架在软骨修复过程中所起的作用至关重要。软骨组织工程支架主要用来为构建软骨细胞提供三维空间结构，利于细胞的黏附、增殖，为细胞的生长提供良好的生长环境。[0003]目前，常用的软骨组织工程支架主要采用天然生物支架材料制备而成，例如，丝素蛋白、纤维蛋白和胶原蛋白等蛋白质类，琼脂糖、藻酸盐、透明质酸和壳聚糖等糖类，采用上述天然生物支架材料制备的软骨组织工程支架不仅能够促进正常细胞外基质的生成及重塑，且在生物相容性、生物降解及成软骨分化(即软骨诱导能力)方面具有不可比拟的优势。[0004]在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题:[0005]现有技术采用上述蛋白质类、糖类等材料制备软骨组织工程支架，由于蛋白质类、糖类等材料的力学强度较差，导致所制备的软骨组织工程支架的力学强度较差，从而使现有技术软骨组织工程支架在临床应用中的持久性较差。
[0006]为了解决现有技术软骨组织工程支 架的力学强度较差的问题，本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架及其制备方法。所述技术方案如下:[0007]—方面，本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架，所述软骨组织工程支架的成分包括天然高分子水凝胶和脱钙骨基质。
[0008]作为优选，所述天然高分子水凝胶为壳聚糖水凝胶。
[0009]另一方面，本发明实施例还提供了一种软骨组织工程支架的制备方法，所述方法包括:
[0010]制备脱钙骨基质，配制天然高分子水凝胶溶液，将所述天然高分子水凝胶溶液注射至所述脱钙骨基质中，使所述天然高分子水凝胶溶液完全渗入所述脱钙骨基质中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到所述软骨组织工程支架。
[0011]作为优选，所述天然高分子水凝胶溶液在20°C时的粘度为100~400cP。
[0012]具体地，所述预设温度为34_38°C。
[0013]具体地，所述制备脱钙骨基质具体为:
[0014]将股骨上附着的软组织剔去，得到修整的股骨；
[0015]取所述修整的股骨的骨骺并清洗；
[0016]将所述骨骺切割成预定大小的骨块，对所述骨块进行脱脂处理；
[0017]利用EDTA脱钙技术对脱脂后的骨块进行脱钙，待所述骨块完全脱钙后，对所述骨块进行修剪、消毒，得到所述脱钙骨基质，并于4°C保存。
[0018]具体地，所述配制天然高分子水凝胶溶液具体为:
[0019]配制浓度为2.5%g/ml的壳聚糖的乙酸溶液，高压灭菌后于4°C保存；
[0020]配制浓度为60%的甘油磷酸钠溶液，除菌后于4°C保存；
[0021]在冰浴环境中，将所述甘油磷酸钠溶液滴加到所述壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，得到所述天然高分子水凝胶溶液，室温保存；
[0022]所述甘油磷酸钠溶液与所述壳聚糖的乙酸溶液的质量比为1:9。
[0023]作为优选，所述壳聚糖的脱乙酰度大于等于95%。
[0024]本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是:
[0025]本发明实施例提供了一种由天然高分子水凝胶和脱钙骨基质制备得到的软骨组织工程支架，通过将天然高分子水凝胶与脱钙骨基质相结合，一方面，该软骨组织工程支架具备了水凝胶的可塑性、粘附性和可注射性，使其具备了天然生物支架材料本身所带来的各种优势；另一方面，脱钙骨基质能够提供胶原纤维网架，赋予所制备的软骨组织工程支架更高的力学强度和诱导能力，进一步促进了细胞的粘附、增殖和分化。
[0026]本发明实施例还提供了一种软骨组织工程支架的制备方法，通过将配制的天然高分子水凝胶溶液注射至脱 钙骨基质中，使水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质中的空隙中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到力学强度及诱导能力较高的软骨组织工程支架。该方法简单，易操作，实用性高。



[0027]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1是本发明实施例提供的软骨组织工程支架的制备方法流程图；
[0029]图2是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的制备方法流程图；
[0030]图3是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的扫描电镜图；
[0031]图4是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的应力应变特性示意图；
[0032]图5是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的弹性模量示意图；
[0033]图6是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的平衡膨胀率对比示意图；
[0034]图7是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的生物降解率对比示意图；
[0035]图8a和图Sb是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的生物相容性对比示意图；
[0036]图9a、图％、图9c、图9d和图10是本发明又一实施例提供的软骨组织工程支架的软骨诱导能力对比示意图。
[0037]其中，I天然高分子水凝胶，
[0038]2脱钙骨基质，
[0039]3软骨组织工程支架。
[0040]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
[0041]实施例1
[0042]本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架3，该软骨组织工程支架3的成分包括:天然高分子水凝胶I和脱钙骨基质2。
[0043]本发明实施例提供了一种由天然高分子水凝胶I和脱钙骨基质2制备得到软骨组织工程支架3，通过将天然高分子水凝胶I与脱钙骨基质2相结合，一方面，该软骨组织工程支架3具备了水凝胶的可塑性、粘附性和可注射性，使其具备了天然生物支架材料本身所带来的各种优势；另一方面，脱钙骨基质2能够提供胶原纤维网架，赋予所制备的软骨组织工程支架3更高的力学强度和诱导能力，进一步促进了细胞的粘附、增殖和分化。
[0044]实施例2
[0045]本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架3，该软骨组织工程支架3的成分包括:天然高分子水凝胶I和脱钙骨基质2。
[0046]天然高分子水凝胶I具有高含水性、可塑性及可注射性，是组织工程研究的常用材料。天然高分子水凝胶I最大的优势是能使包裹的细胞维持圆球形的软骨细胞表型及不发生去分化。其能设计成液体形态使其具备可注射性，能与软骨修复细胞较好的混合，避免细胞丢失。可见，天然高分子水凝胶I具备的可注射性、高粘附性，使其能够广泛应用在微创医学领域。此外，由于水凝胶可在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解，使得其与充盈有大量水性液体的机体组织 及其相似，而且水凝胶柔软，润湿的表面能够与组织亲和，极大减少了其对周围机体组织的刺激性，从而使其具有了良好的生物相容性。
[0047]脱钙骨基质2是一种天然固态生物材料，不仅具备一定的力学强度，而且生物相容性高。发明人研究发现脱钙骨内含有的生物因子，能在不同的环境下诱导出相应的再生组织，这些特性使其在骨骼运动系统修复上有一定优势。通过严格的脱钙及脱细胞制备过程，脱钙骨基质2的主要成分仅由一种胶原纤维网架构成，不具有生物毒性及免疫源性，同时能够促使各种组织细胞的粘附、增殖、分化等。虽然脱钙骨基质2拥有较大的孔隙，约300~600um之间，容易造成细胞的逸漏，不利于与体内组织的粘附整合，但本发明实施例通过将一定粘度的天然高分子水凝胶I溶液注入该脱钙骨基质2中的孔隙内，使脱钙骨基质2的孔隙内完全充满水凝胶成分，有效避免细胞的遗漏，而且通过两者结合所制备的软骨组织工程支架3能够与周边组织紧密粘附，从而促使软骨组织与周边组织形成整体化修复。
[0048]作为优选，该天然高分子水凝胶I为壳聚糖水凝胶。
[0049]壳聚糖是一种来源广泛，廉价易得，且具有良好的生物相容性、安全性和生物降解性的用于制备水凝胶的理想材料。壳聚糖具有温敏性，其在室温或低于室温时可保持液态较长时间，而温度升高到生理体温(37°C )后则发生凝胶化，生成水凝胶。基于此，本发明实施例优选壳聚糖水凝胶。本发明实施例通过将天然的壳聚糖水凝胶与天然固态支架结合，利用壳聚糖的温敏性，使壳聚糖溶液发生凝胶化生成壳聚糖水凝胶，制备成一种软骨组织工程固胶双相支架。这种固胶双相支架不仅能保留水凝胶的可注射性、高含水性、粘附性、可塑性，还能利用脱钙骨提供的胶原纤维网架，赋予支架更高的力学强度，避免了单纯增加水凝胶交联密度而出现的骨分化或软骨肥大，最终能够诱导出适宜的成软骨分化。
[0050]可以理解的是，该天然高分子水凝胶I还可选自明胶、胶原、纤维蛋白、透明质酸盐、海藻酸盐和琼脂糖中的任意一种。
[0051]实施例3
[0052]如附图1所示，本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架3的制备方法，该方法包括:
[0053]步骤101:制备脱钙骨基质2。
[0054]步骤102:配制天然高分子水凝胶溶液。
[0055]步骤103将天然高分子水凝胶溶液注射至脱钙骨基质2中，使该天然高分子水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质2中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到软骨组织工程支架3。
[0056]其中，上述使该天然高分子水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质2中指的是天然高分子水凝胶溶液完全充满脱钙骨基质2中任何空隙的一种理想状态。
[0057]本发明实施例还提供了一种软骨组织工程支架3的制备方法，通过将配制的天然高分子水凝胶溶液注射至脱钙骨基质2中，使天然高分子水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质2中的空隙中，并在预设温度下进行凝胶化反应，得到力学强度及诱导能力较高的软骨组织工程支架3。该方法简单，易操作，实用性高。
[0058]实施例4
[0059]如附图2所示，本发明实施例提供了一种软骨组织工程支架3的制备方法，该方法包括:
[0060]步骤201:制备脱钙骨基质2:
[0061]将股骨上附着的软组织剔去，得到修整的股骨；
[0062]取修整的股骨的骨骺并清洗；
[0063]将骨骺切割成预定大小的骨块，并对骨块进行脱脂处理；
[0064]利用EDTA脱钙技术对脱脂后的骨块进行脱钙，待骨块完全脱钙后，对骨块进行修剪、消毒，得到脱钙骨基质2，并于4°C保存。
[0065]步骤202:配制天然高分子水凝胶溶液:
[0066]配制浓度为2.5%g/ml的壳聚糖的乙酸溶液，高压灭菌后于4°C保存；
[0067]配制浓度为60%的甘油磷酸钠溶液，除菌后于4°C保存；
[0068]在冰浴环境中，将质量份分别为I等份的甘油磷酸钠溶液滴加到9等份的壳聚糖的乙酸溶液中，搅拌至澄清，室温保存。
[0069]其中，还可选用其他弱酸溶液来溶解壳聚糖，例如，草酸、碳酸等。
[0070]作为优选，该天然高分子水凝胶溶液在20°C时的粘度为100~400cP。
[0071]为了保证天然高分子水凝胶溶液兼具较好的可注射性和粘附性，本发明实施例将该天然高分子水凝胶溶液在20°C时的粘度控制为100~400cP。
[0072]作为优选，该壳聚糖的脱乙酰度大于等于95%。
[0073]为了保证壳聚糖能够容易地在乙酸溶液中溶解，且保持其高分子量、高粘度的特性，从而保证所制备的软骨组织工程支架3具有结构形态完好均一，本发明实施例将壳聚糖的脱乙酰度控制在大于等于95%，例如96%、98%等。[0074]步骤203:将该天然高分子水凝胶溶液注射至脱钙骨基质2中，使天然高分子水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质2中，并在34-38°C下进行凝胶化反应，得到软骨组织工程支架3。
[0075]其中，上述使天然高分子水凝胶溶液完全渗入脱钙骨基质2中指的是天然高分子水凝胶溶液完全充满脱钙骨基质2中任何空隙的一种理想状态。
[0076]实施例5
[0077]制备脱钙骨基质2:
[0078]I)将股骨上附着的肌肉、筋膜、脂肪等软组织剔去，仅保留骨性成分。
[0079]2)将修整的股骨进行切割，选取骨骺端，利用生理盐水冲洗残留的骨髓3次。[0080]3)将冲洗后的骨骺切割成4X4X2cm3大小的骨块，悬浸于脱脂液(甲醇:氯仿=1:1)内，进行脱脂处理48小时。
[0081]4)脱钙液配制:用去离子水配制0.5M乙二胺四乙酸脱钙液，控制其PH=8.3，脱钙液保存及脱钙过程均在4°C下用塑料容器盛载(避免玻璃容器)。
[0082]5)生理盐水冲洗脱脂后骨块，浸泡于乙二胺四乙酸脱钙液中，脱钙液每日更换。
[0083]6)脱钙完全度检测:每日换下的脱钙液用原子吸收分光光度计检测钙离子浓度以监测脱钙进程，当脱钙液中的钙(Ca)螯合物浓度〈0.5g/L，即为完全脱钙，脱钙后的标本进行X线和CT检测，证明完全脱钙。
[0084]制备天然高分子水凝胶溶液:
[0085]I)壳聚糖的乙酸溶液配制:用去离子水配制0.1M乙酸溶液，将2.5g壳聚糖颗粒加到100mL乙酸溶液内，磁力搅拌48小时至完全溶解，高压灭菌后分装4°C保存。
[0086]2)甘油磷酸钠溶液配制:去离子水配制60%甘油磷酸钠溶液，0.22um过滤除菌，4°C保存。
[0087]3)冰浴搅拌下，将质量份分别为I等份的甘油磷酸钠溶液缓慢滴加进9等份的壳聚糖的乙酸溶液内，搅拌至澄清，得到天然高分子水凝胶溶液，室温保存。
[0088]制备软骨组织工程支架:
[0089]使用20ml注射器抽取上述配制好的天然高分子水凝胶溶液，并将其注射至上述制备好的脱钙骨基质2上，使该天然高分子水凝胶溶液完全渗透进脱钙骨基质2的孔隙内，然后在37°C或体温下使该天然高分子水凝胶溶液在脱钙骨基质2中发生凝胶化反应，使溶液转变成天然高分子水凝胶，制备得到软骨组织工程支架3。
[0090]通过扫描电镜分别对比观察天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和所制备的软骨组织工程支架3的结构，如附图3所示，软骨组织工程支架3有效并充分地将上述两者进行了结合，形成一体结构。该软骨组织工程支架3不仅保留了天然高分子水凝胶I的有利的微观结构，即30~70um的微孔，且利用了脱钙骨基质2的300~600um的胶原蛋白网架，使该软骨组织工程支架3有效保留大量细胞。
[0091]分别对天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和本发明实施例制备的软骨组织工程支架3的应力承受能力进行测试，如附图4所示，本发明实施例制备的软骨组织工程支架3表现出最佳的应力承受能力。可见，本发明实施例制备的软骨组织工程支架3有效解决了现有技术组织工程支架力学强度低的缺陷，不仅具备了较高的力学强度，且具备天然高分子材料在生物组织工程应用中的各种优势，具有较强的适应性和实用性。[0092]分别对天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和本发明实施例制备的软骨组织工程支架3的弹性模量进行测试，如附图5所示，本发明实施例提供的软骨组织工程支架3表现出最高的弹性模量，具有更高的抵抗形变的能力，进一步增加了本发明实施例制备的软骨组织工程支架3在软骨组织工程修复领域中的优势。
[0093]本发明实施例分别对天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和本发明实施例制备的软骨组织工程支架3的理化特性进行检测:
[0094]平衡膨胀率(ESR, Equilibrium swelling ratio)的测定:将上述天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3分别进行24小时冷冻干燥处理，并测其重量(Wd)，然后放进磷酸盐缓冲液内，在37°C下进行孵育。在不同时间点，取出上述天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3，用滤纸清除上述各材料的表面水分后，立即用微量天平进行称重(Ws)。根据公式ESR=(Ws-Wd)/Wd计算各个时间点的平衡膨胀率。如附图6所示，相比天然高分子水凝胶1，软骨组织工程支架3在磷酸盐缓冲液内没有出现明显膨胀，该软骨组织工程支架3的形状及力学性质能够得到有效保护。
[0095]生物降解测定:将天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3分别在37°C下进行24小时的磷酸盐缓冲液孵育，使天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3在磷酸盐缓冲液内达到平衡后，分别测其重量(W0)。然后再放回37°C的磷酸盐缓冲液内进行降解，在各个时间点取出天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3，测量上述各材料的剩余质量(Wt)，利用公式:降解率=100%X (WO-Wt)/WO来计算上述各材料的生物降解率。如附图7所示，相对于脱钙骨基质2，软骨组织工程支架3具有与天然高分子水凝胶I相当的生物降解性，利于内部细胞增殖与分化。
[0096]实施例6
[0097]本发明实施例分别对上述制备的天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和期望的软骨组织工程支架3的细胞相容性进行了检测，具体过程如下:
[0098]1)骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的原代培养及传代:商品化SD大鼠骨髓间充质干细胞Pl代(RASMX-01001，广州赛业)，复苏后加入含10%胎牛血清的MEM-α培养基(minimum essential medium), 2~3天换一次液，并传一代，传至P4代进行支架细胞相容性检测。
[0099]2)P4代大鼠BMSC，胰酶消化，计算细胞数量，离心，用预先配制的壳聚糖溶液重悬细胞，细胞密度控制在3 X 106/ml。
[0100]3)分别将天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和期望的软骨组织工程支架3转移至6孔板内，37°C孵育15分钟。
[0101]4)在6孔板内添加含10%胎牛血清的MEM- α培养基于37 °C孵箱培养。
[0102]5)培养72小时后，收集上述天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3，进行细胞相容性检测:live/dead染色检测细胞保留量及存活度；免疫荧光观察细胞骨架形态。
[0103] 如附图8a所示，通过live/dead检测发现，上述天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3均能支持BMSC存活，但软骨组织工程支架3能保留更多的BMSC，且BMSC的空间分布更均匀。(其中，电镜图上的白点均表示存活的BMSC)。如附图8b所示，通过免疫荧光观察细胞骨架形态发现，软骨组织工程支架3内的细胞呈圆形或椭圆形，且具有聚集现象，有利于成软骨分化的发生及表型维系(其中，电镜图上的白色区域均表示细胞骨架的形态)。
[0104]实施例7
[0105]本发明实施例分别对上述制备的天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和期望的软骨组织工程支架3的软骨诱导能力进行了检测，具体过程如下:
[0106]DBMSC原代培养及传代:商品化SD大鼠骨髓间充质干细胞Pl代(RASMX-01001，广州赛业)，复苏后加入含10%FBS的MEM- α培养基，2~3天换一次液，并传一代，传至Ρ4代进行软骨分化能力检测。
[0107]2)Ρ4代大鼠BMSC，胰酶消化，计算细胞数量，离心，用预先配制的壳聚糖溶液重悬细胞，细胞密度控制在I X 107/ml。
[0108]3)分别将天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和期望的软骨组织工程支架3转移至6孔板内，37°C孵育15分钟。
[0109]4)将商品化软骨诱导培养基(RASMX-90041，广州赛业)添加到上述各6孔板内，37°C孵箱培养，2~3天更换诱导培养液。
[0110]5)在不同培养时间，收集天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2和软骨组织工程支架3，进行细胞增 殖及软骨分化检测，包括CCK-8试剂盒(Cell Counting Kit-8)测定，RT-PCR(Real Time-Polymerase Chain Reaction,实时聚合酶链反应)测定，GAG(Glycosaminoycan,软骨糖胺多糖)测定，以及免疫突光检测一型胶原(collagenl,C0L1)及二型胶原(collagen2，C0L2)。
[0111]如附图9a和9b所示，体外培养BMSC—段时间后，本发明期望的软骨组织工程支架3内的细胞增殖更明显；如附图9c所示，本发明期望的软骨组织工程支架3产生了更多的软骨特异性细胞外基质:软骨糖胺多糖；如附图9d所示，在基因水平上，本发明期望的软骨组织工程支架3也表现出显著的软骨分化。
[0112]如附图10所示(电镜图上的灰白色区域均表示二型胶原蛋白)，相比天然高分子水凝胶1、脱钙骨基质2，本发明期望的软骨组织工程支架3更能促进二型胶原蛋白的分泌，可见，本发明期望的软骨组织工程支架3能更有效地促进细胞增殖，诱导软骨分化的发生，有利于软骨基质的生成，最终促进BMSC的成软骨分化，对于软骨组织的修复具有重要的意义。
[0113]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。