专利名称：一株生产木糖醇的耐高温酵母菌及其应用的制作方法木糖醇是天然五碳多元醇，是重要的功能性食品添加剂之一。木糖醇的甜度是蔗糖的1.05倍，其代谢无需胰岛素，可替代蔗糖作为糖尿病患者食用的甜味剂、营养剂和药剂等。近年来，木糖醇的市场需求不断扩大，目前世界木糖醇的市场估计在3.6亿美元，国内木糖醇的年产值已超过10亿元。此外，木糖醇在医药、化工、食品、涂料、皮革等工业中应用广泛。木糖醇也是一种平台化学品，通过生物或化学的方法可以转化为1，2_丙二醇，乙二醇等多种化工产品。目前木糖醇的生产主要是通过木糖化学氢化的催化方法。化学法需将玉米芯水解液浓缩、结晶得到木糖后重新溶解稀释，加氢后再浓缩、结晶，能耗高。另外化学法使用金属粉末催化剂，对产品的分离，特别是食品级的木糖醇生产带来较高的分离成本，产品用于食品时有一定的风险。还有化学法需制氢!，加氢!在闻温闻压下进行，设备要求闻。针对化学法生产木糖醇存在的问题，国际上从20世纪70年代开始研究用微生物法来生产木糖醇。微生物法的原理是是利用细胞内的木糖还原酶，将木糖还原为木糖醇，氢来自细胞内的还原性辅酶和氢离子，不需另行制氢。微生物反应在常温常压下进行，能耗低、设备简单、操作安全，又由于酶的底物专一性，使得原料不必高度精制。生物法生产木糖醇将具有污染少、产品质量高等优点，极具发展前景。国内外多年研究开发获得了一系列糖醇转化率超过0.8g/g,个别甚至超过0.95g/g的菌株,使得木糖醇生物制造的工业化成为可倉泛(Silva et al:Enzyme Microb Technol, 2012 ；Ahmad et al:Bioprocess BiosystEng，2011 ;Rodrigues et al:JInd Microbiol Biotechnol，2011 ;Cheng et al:MicrobCell Fact，2011 ;Prakash et al:Bioresour Technol，2011 ;Chen et al:Int J BiolSci，2010 ;Nair and Zhao:Metab Eng，2010 ;Sasaki et al:Appl Microbiol Biotechnol，2010 ；Kumar et al:J Ind Microbiol Biotechnol，2009 ；Akiinerinwa et al:Curr OpinBiotechnol，2008 ； Granstrom et al:Appl Microbiol Biotechnol, 2007a ； Granstrom etal:Appl Microbiol Biotechnol, 2007b ；Silva et al:Appl Biochem Biotechnol，1998)。但是高效、经济性地实现木糖醇的微生物法生产和制造，仍然有一系列的关键技术需要进一步突破，其中高性能生产菌株的选育改造是实现木糖醇微生物制造的核心，其他包括发酵工艺的优化和产物的绿色分离纯化等也需要进一步的研究和开发。
本发明的目 的是提供一株能够耐受高温、生产木糖醇的酵母菌和生物转化生产木糖醇的方法及应用。本发明所提供的耐高温木糖醇生产酵母菌为麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)TIB-Y1020已于2011年12月2日藏保于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称 CGMCC)，保藏号为 CGMCC No 5521。目前已有的利用酵母菌进行木糖醇生产都是30°C左右的温度下进行的。由于细胞在代谢木糖生产木糖醇的过程中将产生热量，在工业生产过程中需要消耗大量的冷却水来降低温度，以维持30°C左右的生产过程。初步计算表明利用30°C的木糖醇生产，每生产I吨木糖醇将消耗50吨以上的冷却水，如果提高生产温度到40°C以上，则冷却水的用量可降低到25吨以下。所以提高木糖醇的生产温度可以大幅度降低冷却水用量，减少能量消耗，从而降低木糖醇生产成本。要实现40°C左右较高温的木糖醇生产，就必须有合适的耐高温生产菌株。因此提高酵母菌对温度的耐受性，使其能在高温环境下生长良好且木糖醇的生产水平不会降低对工业生产的意义十分重大。为了改善菌株工业适应性，我们从自行分离能高效转化木糖生产木糖醇的麦芽糖假丝酵母出发，利用适应进化(adaptive evolution)的方法对菌株进行高温环境的适应性驯化，得到一株能够在40°C能生长良好，且不影响木糖醇生产的酵母菌麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020 CGMCC No5521。本发明的目的是提高了菌株生物转化生产木糖醇的温度，使其能够在高温环境下适应生长的同时不影响生产木糖醇的产量和产率。利用该酵母 菌进行高温转化木糖生产木糖醇有如下优点:1)原料利用率高。化学法以纯木糖为原料，玉米芯水解液中有30%以上的木糖在母液中无法利用。高温生物转化法直接以玉米芯水解液为原料，并利用了废木糖母液，使原料利用率有较大提高。2)生产效率高:该菌种具有多次反复使用的能力，因此单位细胞的木糖醇产量可高出国际最高水平近10倍，单位体积发酵罐的木糖醇产量可高出国际最高水平20倍以上。3)环境污染低。由于原料预处理过程不可避免地会产生一定环境污染，因此提高了原料利用率的同时也减轻了环境污染。此外，生物转化过程也比化学催化过程对环境友好。4)生产设备简单。化学法需制氢，加氢在高温高压下进行，设备要求高。发酵法主要设备是发酵罐，也较复杂。生物转化法只用极少发酵罐，主要设备是简单的反应槽。5)操作简单、安全。转化过程在常温、常压下进行，并且无需无菌操作。与化学法或发酵法比较，操作是最简单、最安全的。6)产品质量好。生物法避免了与金属粉末催化剂的接触，产品更适于作为食品。生物转化系统又没有发酵系统的培养基组分，因此产品质量更可靠。具体实施以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。实施例1 耐温麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)TIB-Y1020 CGMCCNo5521 的获得自行分离的麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)接种于适应进化培养基，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:木糖10%，牛肉膏3 %，KH2PO40.1 %,MgSO4.7Η200.05%。在含有IOmL培养基的50ml摇瓶中于37°C、220r/min的培养12小时后，然后以0.2个0D600值接种于新鲜的相同培养基中，以相同的方法传代培养。以此类推，使菌株适应37°C的环境生长稳定后，用相同的培养基和培养条件逐渐提高生长温度，进行适应性驯化直到温度达到40°C，使其仍能够稳定生长，且增长量与出发菌株在30°C生长量基本相同，从而得到麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) TIB-Y1020 CGMCC No5521。实施例2 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) TIB-Y1020CGMCC No552130°C 和40°C木糖醇生产对比麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) TIB-Y1020CGMCC No5521接种于种子培养基中，该培养基pH为5.5，含有下述质量百分比的组分:木糖5 %，蛋白胨I %，酵母膏I %，在装有20mL的250ml摇瓶中分别于30°C和40°C 220r/min的培养24小时后，2000r/min离心收集菌体，重新悬浮菌体在装有20mL，20%木糖溶液的250mL摇瓶中。30°C培养的菌体继续在30°C、40°C培养的菌体继续在40°C，220r/min的培养36-48小时，分别用高效液相法测定反应液中的木糖消耗和木糖醇的生成。麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCC No5521在30°C转化时需要48小时消耗完木糖，生成160g/L的木糖醇，而在40°C转化时只需要40小时就消耗完木糖，生产约165g/L的木糖醇。在基本有相同转化效率的情况下，40°C转化需要更少的生产时间，从而有更高的生产强度。实施例3 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) TIB-Y1020CGMCC No5521 的 40°C摇瓶转化生产木糖醇 麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCC No5521接种装有25mL细胞培养基的500mL摇瓶中，该培养基的PH为5.4，含有下述质量百分比的组分:木糖3%，蛋白胨I %，酵母膏0.5%。在40°C、220r/min的培养16小时后，离心收集菌体，重新悬浮菌体在装有25mL，含有20%木糖的木糖母液的250mL摇瓶中。在40°C 220r/min进行培养，用高效液相法测定反应液中的木糖消耗和木糖醇的生成。麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCC No5521在48小时可生产生成169g/L的木糖醇。继续离心回收菌体进行9轮转化木糖生产木糖醇，木糖醇产量可维持在155g/L-165g/L之间。实施例4 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) TIB-Y1020CGMCC No5521 的 5L 发酵罐发酵生产木糖醇麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCC No5521接种装有50mL细胞培养基的500mL摇瓶中，该培养基的PH为6，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨为2%。，在40°C、220r/min的摇床培养8小时后，把50mL培养液接种有5000mL细胞培养基的
7.5L发酵罐(NBSBioFlo 115)中，该培养基含有下述质量百分比的组分:木糖5%，大豆蛋白胨2%，酵母膏1%。通过5M的NaOH实时控制pH为5.5左右。在40°C，通气量为1:1的条件下培养24小时后，离心收集菌体，重新悬浮菌体在装有5000mL，含有15%木糖的木糖母液的的7.5L发酵罐(NBSBioFlo 115)中。通气量为1:1的条件下培养36小时后，用高效液相法测定反应液中的木糖消耗和木糖醇的生成。麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCCNo5521在36小时可生产生成122g/L的木糖醇。实施例5 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa) TIB-Y1020CGMCC No5521 的 30L 发酵罐转化生产木糖醇麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCC No5521接种装有IOOOmL细胞培养基的5000mL摇瓶中，该培养基的pH为6，含有下述质量百分比的组分:葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨为2%。，在40°C、220r/min的摇床培养8小时后，把IOOOmL培养液接种有20L细胞培养基的30L发酵罐(镇江东方GUJS-30型)中，该培养基含有下述质量百分比的组分:木糖5%，大豆蛋白胨2%，酵母膏1%。通过5M的NaOH实时控制pH为5.5左右。在40°C，通气量为1:1的条件下培养24小时后，离心收集菌体，重新悬浮菌体在装有20L，含有20%木糖的木糖母液的OL发酵罐(镇江东方⑶JS-30型)中。通气量为1:1的条件下培养20小时后，用高效液相法测定反应液中的木糖消耗和木糖醇的生成。麦芽糖假丝酵母TIB-Y1020CGMCCNo5521在48小时可生产生成166g/L的木糖醇。


木糖醇是是重要的功能性食品添加剂和化工原料，该产品具有广泛的用途。本发明利用高温适应进化的方法，筛选到一株耐受高温的麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)TIB-Y1020CGMCC No5521。麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)TIB-Y1020CGMCC No5521能够在38-42℃生长良好，同时不会影响木糖醇的转化生产。耐高温菌株能够减少生产过程中用于降低温度所带来的生产成本的增加，因此该菌株具有广泛的工业应用前景。