一种叶酸和tat肽共修饰的载药脂质体及其制备方法[0002]纳米载体在化疗药物肿瘤选择性递送中显示出巨大潜力，值得关注的是，这种借助纳米技术治疗的方式取得的抗肿瘤效果仍然非常有限，其原因很可能是由于纳米载体不够高效地将化疗药物输送进入肿瘤细胞，限制了化疗药物抗肿瘤活性的发挥。纳米载体透过血管进入肿瘤间质主要通过对流和扩散的方式。与此同时,肿瘤间质中较高的组织间隙压(IFP)促使组织液反向流动到周围组织中，从而妨碍了纳米载体渗透到实体肿瘤内部。透过肿瘤血管间隙和窗孔的纳米载体如能快速被肿瘤细胞摄取，那么IFP所引起的负影响将被缓解。有鉴于此，基于大多数肿瘤细胞表面高度表达一些特异性受体，配体修饰的策略已被广泛采用，连接配体的纳米载体可通过受体-配体介导的内吞被肿瘤细胞选择性摄取。然而，肿瘤细胞表面受体的表达量并不恒定，另外受体-配体介导的细胞内吞存在饱和现象，导致配体修饰的纳米载体改善肿瘤治疗的效果依旧有限。[0003]TAT肽为细胞穿透肽(Cell penetrating peptides, CPPs)中的一种，能够携带多种不同大小和性质的生物活性物质进入细胞，包括小分子化合物、染料、多肽、多肽核酸、蛋白质、质粒DNA、siRNA、200 nm的脂质体、噬菌体颗粒和超顺磁性粒子等，实现治疗药物的细胞跨膜转运。虽然现有的细胞穿透肽跨膜转运作用的确切机制尚不清楚，但许多研究已表明细胞穿透肽氨基酸序列中的碱性氨基酸发挥了主要作用。然而，由于细胞穿透肽缺乏足够的细胞选择性，一定程度上限制了它在药物靶向输送方面的应用。
[0004]叶酸(Folic acid)是一种水溶性的维生素，为人体必需的微量元素，研究表明大多数实体瘤肿瘤细胞表面广泛表达叶酸受体，因此叶酸常被用作肿瘤靶向的配体。为克服叶酸修饰的纳米递药载体在药物靶向递送中存在的上述不足，本发明提供了一种叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体及其制备方法，以期实现抗肿瘤药物的高效肿瘤细胞内递送。[0005]本发明的目的可以通过以下技术方案实现: 一种叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体，组分包括脂质体、长链靶向膜材、短链靶向膜材和药物，所述的脂质体主要成分为磷脂和胆固醇。[0006]所述叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体，包含以下重量份的组分制成:
脂质体1份；
长链祀向膜材1- 10份；
短链靶向膜材1-5份；
药物0.01 -0.2份。
[0007] 所述长链靶向膜材为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-叶酸(DSPE-PEG-FA)，所述短链靶向膜材为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-TAT (DSPE-PEG-TAT)。
[0008]所述长链靶向膜材中的PEG重均分子量选自1000、2000、3400或5000 ;短链靶向膜材中的PEG重均分子量选自750、1000、2000或3400 ;所述长链靶向膜材中PEG重均分子
量大于短链祀向膜材中PEG重均分子量。
[0009]所述脂质体中磷脂选自磷脂豆磷脂、卵磷脂、氢化大豆卵磷脂、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、琥珀酸胆固醇酯和磷脂酰丝氨酸中的一种或一种以上。
[0010]所述药物为紫杉醇、多西他赛、阿霉素、羟基喜树碱、盐酸阿霉素、顺钼、两性霉素B、柔红霉素、胞嘧啶、阿糖胞苷、长春新碱、依托泊苷和伊达比星中一种或几种。
[0011]所述磷脂与胆固醇的质量比为4-5:1。
[0012]一种叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)称取磷脂、胆固醇、长链靶向膜材、短链靶向膜材及药物，用有机溶剂溶解，随后在40°C条件下减压旋干有机溶剂，得到含药脂膜；
(2)向含药脂膜中加入磷酸盐缓冲溶液中溶解，超声2分钟，用0.22 ym膜，过滤10次，得到双靶载药脂 质体。
[0013]一种叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)称取磷脂、胆固醇及药物，用有机溶剂溶解，在40°C条件下减压旋干有机溶剂，得到含药脂膜；
(2)向含药脂膜中加入磷酸盐缓冲溶液中溶解，超声2分钟，用0.22 ym膜，过滤10次，得到载药脂质体；
(3)称取长链靶向膜材和短链靶向膜材，溶解于磷酸盐缓冲溶液中，靶向膜材溶液逐滴滴入步骤(2)中的载药脂质体中，保温，冷却，得到双靶载药脂质体。
[0014]一种叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤:
(1)称取磷脂及胆固醇，用有机溶剂溶解，在40°C条件下减压旋干有机溶剂，得到不含药脂膜；
(2)向不含药脂膜中加入磷酸盐缓冲溶液中溶解，超声2分钟，加压过0.22 μπι膜10次，得到空白脂质体，进一步用磷酸氢二钠水溶液调节pH至7.6，加入药物，700C下，混合30 min，冷却至室温，透析除去游离药物，制得载药脂质体；
(3)随后，称取长链靶向膜材及短链靶向膜材，溶解于磷酸盐缓冲溶液中，逐滴滴入步骤(2)的载药脂质体中，55°C下保温lh，冷却，制备得到双靶载药脂质体。
[0015]所述有机溶剂为氯仿:乙醇=2:1 ;所述磷脂为0.8-0.83重量份；所述胆固醇为
0.17-0.2重量份；所述长链靶向膜材为1- 10重量份；所述短链靶向膜材为1-5重量份；所述药物为0.01 -0.2重量份；所述磷脂与胆固醇的质量比为4-5:1。
[0016]所述的叶酸和TAT肽共修饰的载药脂质体在治疗卵巢癌、肺癌、结肠癌、子宫内膜癌、脑癌、乳腺癌和肾肿瘤疾病中的用途。
[0017]本发明与现有技术相比，其有益效果为:
(I)本发明借助不同重均分子量的PEG连接TAT肽与特异性配体，构建双配体修饰的纳米载体，将有望同时发挥非特异性和特异性配体在细胞内转运药物的优势，提升化疗药物的肿瘤细胞内转运效率。[0018](2)本发明的双靶载药脂质体易于制备，同时其表面配体密度易于控制。
[0019](3)本发明用长链聚乙二醇(PEG)将叶酸分子连接到脂质体表面，用短链聚乙二醇(PEG)连接非特异性的TAT肽，通过静脉注射给药后，在血液循环中TAT肽的非选择性被长链PEG所限制，到达肿瘤部位后，暴露在脂质体最外端的FA可特异识别肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体，并与叶酸受体结合，缩短了 TAT肽和细胞膜间的距离，进而发挥TAT肽的穿膜作用，有效将脂质体带入细胞内。
[0020](4)长链PEG连接特异性配体FA可使其充分暴露在脂质体表面而有效地识别肿瘤细胞表面过度表达的受体，通过柔性的短链PEG连接TAT肽，可降低长链PEG产生的空间位阻,使TAT肽可自由与细胞膜作用。
[0021](5)本发明的双靶载药脂质体在细胞内，其药物递送效率高度依赖于肿瘤细胞表面过度表达的受体，不同于通过化学敏感键连接的纳米载体，不需要任何外加刺激或人为操作，即可实现高效的药物肿瘤细胞内输送。



[0022]图1为本发明实施例1的双靶载药脂质体的粒径分布图。
[0023]图2为阿霉素脂质体和本发明实施例1的双靶载药脂质体的透射电镜(TEM)形态图，其中A为阿霉素脂质体，B为实施例1的双靶脂质体。
[0024]图3为本发明实施例1的双靶载药脂质体与阿霉素脂质体、PEG脂质体和单靶脂质体I在不同阿霉素浓度 下的细胞存活率图。
[0025]图4为流式细胞仪的测试结果图,其中A为PEG脂质体,B为单祀脂质体I,C为单靶脂质体2，D为本发明实施例1的双靶载药脂质体。

[0026]以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0027]测试方法:
粒径与Zeta电位测试方法:取样品用纯水稀释后，采用粒径与Zeta电位仪分别测定粒径及电位，每种样品平行测定三份，测试结果见表1，粒径分布见图1。
[0028]包封率的测定:采用超滤离心法测定包封率，分别取0.5ml的样品，置于IOkD超滤离心管中，10000 rpm，离心15 min，将滤液稀释，采用HPLC进行分析，结果见表1。
[0029]包封率％=(投入的总药量一游离的药量)/投入的总药量X 100%
透射电镜(TEM)形态观察:将待测样品滴加至专用铜网上，干燥后进行TEM扫描，结果见图2。
[0030]脂质体细胞毒性考察:KB细胞用不含叶酸的DMEM培养液于CO2培养箱中，37°C、5%C02、饱和湿度条件下培养，取对数生长期KB细胞用0.25%胰酶消化后，以5X IO4 cells/mL接种于96孔板中，每孔100 μ L，将96孔板移入培养箱中培养24h后，分别加入不同浓度(0.01,0.1,0.5、1、2、2.5、5、10、20 μ g/mL)不同类型阿霉素脂质体溶液及相应游离DOX溶液100 μ L，每组设五复孔，37°C、5% CO2、饱和湿度条件下培养48小时后去除板中的培养液，用PBS清洗两次，加入100 μ L Folate-free DMEM (10% 5 mg/mL MTT)的混合液，同样条件继续培养4 h，之后小心吸去孔内培养液，每孔加入100 uL DMS0，轻轻振荡5 min，使结晶充分溶解，在酶标仪上测492 nm处吸光度(0D492)，由OD值计算细胞存活率，公式为:细胞存活率(Cell Viability) =(实验组OD值一空白组OD值)/ (对照组OD值一空白组OD值)X 100% ;细胞存活率见图3，计算IC50值，如表2。
[0031] 脂质体细胞摄取考察:取对数生长期KB细胞以浓度为IXlO5 cells/mL接种于6孔板中，每孔接种2 mL,贴壁培养24 h后，更换为含各种脂质体的培养液100 μ L培养I h后，弃去培养液，用冷的PBS清洗三次；胰酶消化后离心，弃上清液，加入0.5 mLPBS吹打成细胞悬液，置于流式细胞仪中进行分析。
[0032]实施例1
(1)称取磷脂豆磷脂0.Sg及胆固醇0.2g，用氯仿:乙醇=2:1 (体积比)的有机溶剂溶解，在40°C条件下减压旋干有机溶剂，得到不含药脂膜；
(2)向不含药脂膜中加入pH7.6磷酸盐缓冲溶液中溶解，超声2分钟，加压过0.22 μπι膜10次，得到空白脂质体，进一步用磷酸氢二钠水溶液调节PH至7.6，加入阿霉素0.15g，70°C下，混合30 min，冷却至室温，制得载药脂质体；
(3)随后，称取DSPE-PEG5_-FAIOg及DSPE-PEG2Q(i(1-TAT 5g，溶解于磷酸盐缓冲溶液中，逐滴滴入步骤(2)的载药脂质体中，55°C下保温lh，冷却，制备得到双靶载药脂质体。
[0033]对实施例1所得的双靶载药脂质体进行测试，粒径如图1所示，可看出双靶载药脂质体粒径分布均匀且均小于200nm，可有效的实现EPR效应；用透射电镜得到形态图，如图2所示，可看出该双靶载药脂质体形态圆整、粒径均一，且配体成功的插入载药脂质体中，同时TAT肽的正电荷被完全屏蔽；图3可看出双靶载药脂质体与PEG脂质体及各单靶脂质体相比，在各个浓度下均表现出较强的细胞毒性；图4可看出双靶载药脂质体与PEG脂质体、单靶脂质体1、单靶脂质体2相比，其荧光强度最强，证明经双靶修饰后能显著提高细胞摄取，表现出更强的肿瘤杀伤活性，有利于发挥抗癌药物的细胞毒作用。
[0034]实施例2
(1)称取氢化大豆卵磷脂0.8g、胆固醇 0.2g、DSPE-PEG34QQ-FA lg、DSPE-PEG3(l(l(l-TAT Ig及羟基喜树碱0.2g，用氯仿:乙醇=2:1 (体积比)的有机溶剂溶解，随后在40°C条件下减压旋干有机溶剂，得到含药脂膜；
(2)向含药脂膜中加入pH7.6磷酸盐缓冲溶液中溶解，超声2分钟，用0.22 ym膜，过滤10次，得到双靶载药脂质体。
[0035]实施例3
(1)称取卵磷脂0.Sg、胆固醇0.2g及紫杉醇0.01 g，用氯仿:乙醇=2:1 (体积比)的有机溶剂溶解，在40°C条件下减压旋干有机溶剂，得到含药脂膜；
(2)向含药脂膜中加入pH7.6磷酸盐缓冲溶液中溶解，超声2分钟，用0.22 ym膜，过滤10次，得到载药脂质体；
(3)称取DSPE-PEGiqqq-FAIOg和DSPE-PEG75(l-TAT5g，溶解于磷酸盐缓冲溶液中，逐滴滴入步骤(2)中的载药脂质体中，保温，冷却，得到双靶载药脂质体。
[0036]对比例
PEG脂质体、单靶脂质体I和单靶脂质体2的制备方法如下:
分别取 DSPE-PEG5cicic1-FA、DSPE-PEG2000-TAT 和 DSPE_PEG5__NH2 靶向膜材，分别溶于 pH
7.6的磷酸盐缓冲液中，按靶向膜材与磷脂的摩尔比分别为5%、2.5%及5%，分别吸取靶向膜材溶液滴入等量的阿霉素脂质体中，55°C下保温lh，冷却，分别得到单靶脂质体1、单靶脂质体2及PEG脂质体。
[0037]单靶脂质体3 的制备方法为:将 5% 的 DSPE-PEG5qqq-NH2 及 2.5% 的 DSPE-PEG2(I(I(1-TAT的膜材水溶液滴入等量的阿霉素脂质体中，55°C下保温lh，冷却，得到单靶脂质体3。
[0038]表1不同类型脂质体粒径、电位及包封率(/7=3)