小分子多肽TAT-p53DM及其在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用的制作方法[0006]本发明目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM，其序列为SEQ ID N0.1所示。本发明将 TAT 穿膜妝(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, YGRKKRRQRRR)与p53蛋白的DNA结合基序(p53DM)的一段氨基酸序列(氨基酸270-281, Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr, RVCACPGRDRRT)连接，得到具有生物活性的 TAT_p53D M小分子多肽，利用TAT的穿膜功能将p53DM多肽输送进入血液穿过血脑屏障，并被大脑神经细胞摄取从而发挥其生物学功能。[0007]本发明的目的还在于提供了小分子多肽TAT-p53DM对应的核苷酸序列，具体为SEQ ID N0.2 7](tatggccgcaaaaaacgccgccagcgccgccgc-cgcgtgtgcgcgtgcccgggccgcgatcgccgcacc)，但不局限于该序列，所有编码TAT-p53DM多肽的核苷酸序列都为本发明的保护范围。[0008]本发明的另一个目的在于提供了一种小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物中的应用，将其与神经元细胞共同孵育或是静脉注射，发现其可有效降低缺血性卒中后神经元死亡(坏死与凋亡)，并明显改善缺血后神经系统症状与行为学的效应。[0009]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:[0010]本发明的思路如下:[0011] 申请人:发现,缺血性卒中后，死亡相关蛋白激酶I (Death Associated ProteinKinasel, DAPKl)的死亡功能域(Death Domain, DD)和肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合基序(DNA binding Motif, DM)相互作用，并介导下游神经元坏死与凋亡。阻断DAPK1DD与p53DM的相互作用，能有效降低缺血性卒中后神经元死亡(坏死与凋亡)。针对这一发现， 申请人:将 TAT 穿膜妝(Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg, YGRKKRRQRRR)与 p53 蛋白DNA结合基序(p53DM)的一段氛基酸序列(氛基酸270-281, Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-Gly-Arg-Asp-Arg-Arg-Thr, RVCACPGRDRRT)连接，获得具有生物活性的 TAT_p53DM 多肽，通过对离体培养的神经元进行孵育，TAT-p53DM多肽直接被神经元摄取；也可通过在体静脉注射方式，使TAT-p53DM多肽进入血液穿过血脑屏障并被大脑神经细胞摄取发挥其生物学功能。[0012]一种小分子多肽TAT_p53DM，其序列如下:
[0013]Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Arg-Val-Cys-Ala-Cys-Pro-GIy-Arg-Asp-A rg-Arg-Thr (YGRKKRRQRRR-RVCACPGRDRRT)。
[0014]TAT-p53DM 的对照为 TAT_scramble-p53DM (TAT_s_p53DM)，其序列为:
[0015]Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Cys-Cys-Pro-Gly-Glu-Cys-Val-Arg-Thr-Ar g-Arg-Arg(YGRKKRRQRRR-CCPGECVRTRRR)。
[0016] TAT-p53DM多肽及其对照TAT_s-p53DM为商业化公司合成。
[0017]小分子多肽TAT-p53DM在制备治疗或预防缺血性卒中药物的应用，其应用过程如下:[0018](I) TAT-P53DM在缺血性卒中细胞模型的应用
[0019]氧糖剥夺(Oxygen Glucose Deprivation, 0GD)被广泛认为是缺血性中风的体外细胞模型。我们对体外培养10天的原代神经细胞进行OGD处理60分钟和90分钟，在60分钟OGD处理的情况下，PI标记出46%细胞坏死，TUNEL标记出21%的细胞凋亡。当培养物经过90分钟OGD处理后，PI标记出89%细胞，18%细胞对TUNEL出现阳性反应，可见大部分细胞在OGD处理下死亡。用5 μ M的TAT-p53DM对培养的原代神经元进行孵育处理，OGD处理后的原代培养神经元，被PI和TUNEL标记的细胞数目显著减少，说明TAT-p53DM处理可以在细胞水平降低缺血后神经元死亡。
[0020](2) TAT-p53DM在缺血性卒中动物模型的应用
[0021]大脑中动脉栓塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCA0)是公认的脑缺血动物模型，通过向小鼠颈动脉中插入线拴堵塞大脑中动脉能引起大脑中动脉支配的皮层纹状体缺血，拔出线拴，则引起血流再灌注，从而引起缺血再灌注损伤，以模拟临床脑梗塞或脑栓塞的症状。通过TTC染色反映缺血梗死体积，TUNEL及FJ染色反映缺血后神经元的死亡，转棒实验Rotarod反映动物协调平衡能力，神经系统功能评分(Neurological Score, N.S.)反映缺血后神经系统症状,水迷宫实验反映动物运动与学习记忆能力。对动物缺血再灌注后3小时和6小时的小鼠股静脉注射lmg/ml的TAT_p53DM溶液，动物缺血再灌注第7天处死，取出脑组织，TTC染色显示给予TAT-p53DM的小鼠脑缺血梗死体积显著低于对照组TAT-s-p53DM或生理盐水Vehicle组。TUNEL及FJ染色显示，给予TAT_p53DM的小鼠缺血后神经细胞死亡数量显著低于对照组TAT-s-p53DM或生理盐水Vehicle组。此外，TAT_p53DM注射的小鼠转棒行为学与水迷宫行为学结果均较TAT-s-p53DM或Vehicle组得到显著改善。进一步证明，TAT-p53DM对缺血性卒中模型具有确切的治疗作用。
[0022]与现有技术相比，本发明具有以下特点:
[0023](I)本发明所涉及的小分子多肽TAT-p53DM合成纯度高，完全可溶，适合静脉注射，无毒副作用，便于转化生产；
[0024](2 )本发明利用人工合成TAT蛋白转导结构域和P53DM的融合蛋白多肽，意在采用静脉注射的方式达到改善缺血性卒中后神经系统症状,减少缺血性卒中神经细胞死亡和脑损伤的目的。本发明公开的人工合成的TAT-p53DM重组蛋白多肽，TAT可以携带p53DM蛋白多肽经血液穿过血脑屏障被神经元摄取，可以转化应用于神经系统疾病如缺血性卒中，使其具有实际操作的可行性。



[0025]图1为一种小分子多肽TAT-p53DM的人工合成色谱图。
[0026]图2为TAT-p53DM阻断神经元DAPK1DD与p53DM结合的结果示意图。
[0027]图3为离体细胞水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的流程图。
[0028]图4为TAT-p53DM减少OGD处理后神经元坏死及凋亡的结果统计图。
[0029]图5为在体动物水平TAT-p53DM对缺血性卒中治疗作用的实施方案图。
[0030]图6为TAT_p53DM减少缺血性卒中后缺血梗死体积与神经元死亡的结果统计图。
[0031]图7为TAT-p53DM改善缺血性卒中后运动功能及神经系统症状的结果统计图。
[0032]图8为TAT-p53DM改善缺血性卒中后学习与记忆功能的结果统计图。
[0033]下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。在实施例中涉及的所有细胞培养，凋亡与坏死染色，缺血动物模型，静脉注射以及组织学与行为学的所有操作方法为本领域技术人员所熟知。本发明中未详细阐述的请参见文献(①Tu W，Xu X, Peng L, ZhongX, Zh ang ff, Soundarapandian MM, Balel C，Wang M, Jia N, Zhang W，Lew F，Chan SL, Cheη Y, Lu Y (2010)DAPKlinteraction with NMDA receptor NR2B subunits mediates braindamage in stroke.Cel1140:222-234 ;② Yang Y, Shu X, Liu D, Shang Y,Wu Y, Pei L,X uX, Tian Q, Zhang J, Qian K, Wang YX, Petralia RS, Tu ff, Zhu LQ, Wang JZ, Lu Y (2012) EPACnull muTATion impairs learning and social interactions via aberrant regulati onof miR-124and Zif268translation.Neuron73:774-788.)的材料与方法部分说明。
[0034]实施例1:
[0035]TAT-p53DM的人工合成
[0036]TAT-p53DM的序列为SEQ ID N0.1所示，由武汉百意欣生物技术有限公司人工合成，合成报告如下所示，色谱如图1所示。
[0037]TAT-p53DM 人工合成 HPLC 报告