专利名称：一种新的制备TAT-Oct4的方法0ct4是一种具有很强特异性的胚胎干细胞标志物，而且在哺乳动物胚胎发育过程中0ct4起着严密的不可替代的调控作用。人的0ct4基因长度是16.40kb，位置在6号染色体上(6p21.31)。0ct4也称为0ct3是由Pou5Fl基因编码产生的一种蛋白，属于V类POU蛋白，是一种POU转录因子。POU转录因子是一种DNA结合蛋白，其构成主要包括POU保守结构域(POUS)和POU同源异型结构域(POUH)，由15 55个氨基酸序列中间连接。N端的POU家族特有保 守结构域(POUs)大约由74 82个氨基酸残基构成，C端的同源异型结构域(POUH)大约60个氨基酸残基构成。在POU保守结构域(POUS)和POU同源异型结构域(POUH)都有一个各有脯氨酸富集区域，这两个脯氨酸的富集区域是0ct4因子的转录活性区。0ct4是维持细胞多能性的重要转录因子之一，其主要是通过调控自身下游靶基因而参与正常发育过程，在胚胎早期发育中起着极其关键的作用。有研究认为0ct4基因与胚胎干细胞(ES)细胞分化密切相关，多能干细胞的数量受到0ct4控制。进一步的研究还发现，当ES细胞中0ct4基因的表达水平受到人为的调控可使ES细胞向不同方向分化。2006年日本科学家Takahashi和Yamanaka通过对多种转录因子的筛选,最后利用逆转录病毒将转录因子0ct4等4种转录因子基因转入成纤维细胞，成功地将成纤维细胞重编程为诱导性多功能干细胞(iPS细胞)。随着iPS技术的不断发展，有研究证明通过转录因子0ct4单独诱导重编程也成功得到iPS细胞，这进一步证明了 0ct4在细胞重编程过程中起着极其关键的作用。然而，现有的方法几乎都是利用逆转录病毒将转录因子转入宿主细胞内，由于引入外源DNA的引入容易引起宿主细胞突变，这一现象是当前iPS技术发展中的一个重要难题。能够通过耗能或非耗能形式穿过多种细胞膜的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)被命名为穿膜肽。1988年，Green等和Frankel等首次报道了 HIV-1的反式激活蛋白TAT具有主动穿过多种细胞膜进入细胞内部的作用。随着不断的深入研究，发现穿膜肽除了自身能透过多种细胞膜，还能携带比自身分子量大很多倍的寡聚核苷酸进入细胞内，而且对宿主细胞没有明显的毒副作用。穿膜肽已成为生物和医学领研究域的一个新的热点。我们设计的融合蛋白目的是替代现有的利用逆转录病毒侵染的方式来获得诱导性多功能干细胞(iPS细胞)，利用穿膜肽TAT特有的生物学活性，使0ct4直接作用于宿主细胞，从根本上避免了利用逆转录病毒侵染的方式将外源基因导入受体细胞带来的突变等各种不良后果。巴斯德毕赤酵母是低等真核生物，于20世纪80年代初开发获得。巴斯德毕赤酵母具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服原核表达系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此巴斯德毕赤酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。巴斯德毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统主要有以下几个优点；(I)具有乙醇氧化酶AOXl基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一 O(2)表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合。(3)菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高。(4)巴斯德毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解，而且减少对细胞的毒害作用。(5)营养要求低,培养基成分简单,生产成本低,特别适用于工业化大规模生产。(6)属于单细胞生物，故保留了易于操作和生长速度快的特点。(7)表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞外，巴斯德毕赤酵母自身蛋白质的分泌量很低，十分有利于目的产物纯化。(8)作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修饰。甲基营养酵母，特别是巴斯德毕赤酵母是已被深入研究的真核表达系统，并已被用于表达许多有用的蛋白质 。例如，美国专利5，324，639公开了在甲基营养酵母特别是巴斯德毕赤酵母细胞中生产胰岛素样生长因子I的方法；美国专利5，330，901公开了使用巴斯德毕赤酵母系统表达人血清白蛋白的方法；美国专利5，965，389提供了在甲基营养酵母中表达L-谷氨酸脱羧酶(GAD65)的DNA构建体以及由之制备纯的GAD65的方法；美国专利公开了在巴斯德毕赤酵母中表达血小板衍生的细胞因子(TOGF)的方法；美国专利6，780，615描述了使用重组巴斯德毕赤酵母生产应乐果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未见关于使用巴斯德毕赤酵母生产融合蛋白TAT-0ct4的报道。
本发明涉及蛋白质制备和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达一种穿膜肽(TAT)与人0ct4的融合蛋白(TAT-0ct4)的方法。本发明的一个目的是提供一种集TAT与人0ct4的特性于一体的TAT_0ct4融合蛋白。本发明的TAT与人0ct4融合蛋白是包括与天然TAT序列相同区域和与0ct4序列相同的另一区域。在本发明的融合蛋白中，可以是与天然TAT同源的区域位于融合蛋白的N-端，与人0ct4同源的区域位于融合蛋白的C-端；也可以是与天然TAT同源的区域位于融合蛋白的C-端，与人0ct4同源的区域位于融合蛋白的N-端。 本发明的另一目的是提供编码本发明融合蛋白的DNA序列。包括与天然TAT氨基酸残基序列相同的区域和与人0ct4氨基酸残基序列相同的区域构成的融合蛋白的DNA序列。本发明的再一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产融合蛋白TAT_0ct4多肽的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的:(I)甲醇可诱导的转录启动子；(2)编码TAT_0ct4的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而以至少120mg/L培养基的浓度产生TAT-0ct4多肽。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲醇可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。本发明的又一个目的是提供用于表达融合蛋白TAT_0ct4的甲基营养酵母，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲醇可诱导的转录启动子、编码TAT-0ct4的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲醇可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中TAT_0ct4多肽的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件:甲醇可诱导的转录启动子、编码TAT-0ct4的DNA片段、转录终止子和可选择标志。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲醇可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母AOXl基因。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白非常少，而且培养基中不含有其他的蛋白质，因此巴斯德毕赤酵母分泌的外源蛋白是培养液中总蛋白的主要成份，这样大大降低了对所获得外源蛋白进行分离和纯化的难度，所以分泌表达外源蛋白是一种理想的方式。为了达到这一目的，本发明所使用的信号是经过优选的α因子信号肽。α因子信号肽序列来自于啤酒酵母(S.cerevsia)的 α性成熟因子前导序列，由87个氨基酸组成，并且已将这段序列编码的信号肽插入到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达载体，也可以是分泌表达载体。无论是表达载体还是分泌载体都包括一个由0.9kb的5’ AOXl序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3’序列组成的表达盒。胞内表达载体包括PHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHW010E12U pGApZ、pGAPZ α 等。分泌载体包括 pPIC9、pPIC9k、、pPICZ α、PYAM75P6E6。所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是pPICZa作为融合蛋白TAT_0ct4的表达载体。一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括￥-11430^-6100-3、65115、枷71、51 1168等，本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X-33菌株。巴斯德毕赤酵母X-33菌株具有典型高等真核生物的多种翻译后修饰功能。其中包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、N-型糖基化等。得到携带TAT-0ct4基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。本发明优选了相对于其他转化方法最为方便、快捷的电转移法。重组表达载体导入酵母体内后只有与酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在并得以表达。本发明中，为了稳定地表达目的基因，可以在His或5’ AOXl的单酶切位点将质粒载体线性化(SacI)，使之通过单交换整合到酵母细胞染色体中，从而得到表型为Mut+并具有高甲基利用能力的转化子。本发明中，发酵培养可以使用的培养基有BMG/BMM、BMGY/BMMY、MGY/MMY等培养基，经过优化本实验所选的培养基的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培养基。甲醇作为唯一的碳源和能源，加入量一般为培养体积的0.5 L 0% (V/V)。本发明首次在巴斯德毕赤酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了融合蛋白TAT-0ct4，建立了稳定的融合蛋白TAT-0ct4毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表达相比，本发明的方法具有如下特点:①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子的严格控制，可在甲醇诱导下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且巴斯德毕赤酵母本身的蛋白很少分泌到培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③不存在内毒素污染问题；本发明建立了在巴斯德毕赤酵母中高效分泌表达TAT_0ct4的方法，使用SDS-PAGE, Western印迹分析证实了按照本发明方法生产的TAT_0ct4的理化性质，从而为进一步检测其体内外生物学活性提供了必要条件。在以上研究的基础上，本发明进一步探讨了巴斯德毕赤酵母工程菌制备TAT_0ct4的方法，优化了利用巴斯德毕赤酵母菌制备融合蛋白TAT-0ct4的条件，其中所使用的优化条件包括:培养温度维持在30°C、所使用·的pH值为7.5、并且培养基中添加有2% (W/V)的蛋白胨。本发明建立了巴斯德毕赤酵母工程菌高效表达制备融合蛋白TAT_0ct4的方法。本发明将TAT与人0ct4融合，所形成的融合蛋白既保留了 TAT能高效地介导与其共价连接的多肽、蛋白质等分子跨膜组织和细胞的功能，又保留了 0ct4单独诱导重编程，进而得到类似iPS细胞的活性。因此本发明的融合蛋白既可以通过TAT介导0ct4突破细胞膜而进入宿主细胞，又可以使进入细胞内的0ct4具有诱导重新编程的作用。本发明的研究结果将为融合蛋白TAT-0ct4的高密度工业化生产和临床应用提供必要的基础。
图1显示重组质粒pPICZ a /TAT_0ct4转化巴斯德毕赤酵母菌的PCR鉴定电泳图谱。其中泳道I是DNA分子量标志物(DL2000);泳道2是未转入任何质粒的巴斯德毕赤酵母菌X33基因组DNA的PCR产物；泳道3是空白质粒pPICZ α转化的巴斯德毕赤酵母菌基因组DNA的PCR产物；泳道4 25是不同巴斯德毕赤酵母菌转化子基因组DNA的PCR扩增产物。图2显示时间对TAT_0ct4表达的影响(SDS-PAGE分析)。其中泳道I 7分别为O、24、48、72、96、120、144小时，泳道8是Takara蛋白质分子量标志物，泳道9 11分别为168、192、216小时，诱导表达上清，在192小时表达量最大。图3显示pH值对TAT-0ct4表达的影响(SDS-PAGE分析)。其中泳道I 7分别为ρΗ3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、泳道8是Takara蛋白质分子量标志物，泳道9 11分别为ΡΗ7.0,7.5,8.0条件下，诱导表达120h上清。最佳pH值为7.5。图4 显不 TAT_0ct4 的 Western-blot 分析结果。I:TAT-0ct4, 2:未转入任何质粒的X33阴性对照，3:转化空pPICZ α空质粒的Χ3
实施例1:0ct4基因的克隆和扩增(I)总RNA的提取Trizol法从人肝组织中提取总RNA:将新鲜分离的人肝组织切成约IOOmg大小，立即放入液氮中速冻。按下列方法从组织中提取总RNA。取出冰冻的组织300mg放入盛有液氮的研钵中，将组织碾碎。把碾碎的组织移入50ml离心管中，加入约5mlTrizol，于室温用匀浆器高速匀浆15 30S。加入1.0ml氯仿(200 μ 1/ml Trizol)，充分振荡摇匀，室温放置5min。4°C离心(12000r/min) 15min后将上层水相移至另一离心管中。加入等体积异丙醇，振荡摇勻，室温沉淀IOmin, 4°C离心(12000r/min) 15min,弃上清。加入75%乙醇Iml洗涤沉淀2次，4°C离心(12000r/min) 5min,室温下空气蒸发残存乙醇。将总RNA沉淀溶于50 μ IDEPC处理过的水中，_80°C保存备用。取I μ I样品稀释100倍后经紫外分光光度计测定Α260和Α280，计算其浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。RNA含量按下面公式计算:RNA 浓度(μ g/ μ I) = Α260 X 40 X 稀释倍数 /1000Α260/Α280 = 1.8 2.0 表示纯度合格(2) 0ct4 基因的克隆(RT-PCI^i)RT 反应:在0.2mlEP管中加入上述提取的总RNAl μ g，I μ I OligodT，70°C变性lOmin，冰浴lmin，然后加入下列反应液:`
MgCl2 4 μ I
10 X RNAPCR 缓冲液 2μ1 RNA酶抑制剂0.5 μ I
dNTP(lramol/L) 2μ I
AMV逆转录酶I μ I无RNA酶灭菌超纯水加至终体积20 μ I于PCR仪上42°C反应60min，然后99°C 5min灭活逆转录酶，合成cDNA用于下一步PCR反应。PCR 反应:向上述0.2mlEP管中加入以下反应体系:10 X LAPCR 缓冲液 8 μ ILATaq I μ I上游引物Ιμ 下游引物Ιμ 灭菌超纯水加至终体积100 μ I此PCR反应引物序列如下:上游引物1:5，-CAGCGTCGACGAATGGCGGGACACCTGG-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)
反应在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为:
①94 度 5min②94 度 30s，61 度 30s，72 度 Imin94 度 30s，53 度 30s，72 度 Imin 16 个循环③72 度 5min扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小是否与预期结果吻合，确定是否得到正确目的基因。(3)克隆载体的构建、转化与扩增回收PCR扩增的0ct4基因片段进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。回收后，将0ct4基因片段与T载体16°C连接过夜。连接反应体系包括:0ct4基因片段0.1 0.3pmol ；T载体
0.03pmol ;溶液I (含DNA连接酶和连接缓冲液，见Takara公司T载体试剂盒)5 μ I ;灭菌超纯水至终体积10 μ I。按照常规方法，从37°C培养16小时的XL1-Blue阴性培养板上(不含抗生素的LB琼脂平板)挑取单个菌落，接种于含有IOOmlLB培养基的IL培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-80°C冻存备用。取一份冻存的感受态细胞融化后，加入上述连接产物，进行常规转化。再取200 μ I已转化的感受态细胞涂布于含X-Gal、IPTG (二者可在涂菌前半小时涂于LB琼脂平板表面)和氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB琼脂平板上，37°C培养箱中培养12 16小时。(4)重组载体的鉴定随机挑取转化后的白色单菌落(“蓝白筛选”)，接种于含氨苄青霉素(lOOyg/ml)的LB培养基中，37°C震荡培养(225rpm)过夜，然后常规提取质粒DNA。取1μ I溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。37°C Bstp 1041、EcoR I双酶消化4小时，1%琼脂糖凝胶电泳后根据内切酶谱鉴定正确克隆。挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA测序。测序结果显示插入T载体中的序列与NCBI上公布的人0ct4序列(登录号:BC117435.1) 一致。实施例2:TAT-0ct4毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ a /TAT_0ct4的构建和宿主细胞转化取上述测序鉴定正确的携带人0ct4基因的质粒50ng作为模板，通过PCR引入跨膜肽TAT序列和人血清白蛋白信号肽序列，由于引入的序列较长，PCR反应分两步进行
反应I在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为:①94 度 5min②94 度 30s，60 度 30s，72 度 Imin94 度 30s，53 度 30s，72 度 Imin 16 个循环③72 度 5min此PCR反应引物序列如下:上游引物2:5’-CTCGGCTTATTCGAGGTGTGTTTCGATACGGTAGAAAGAAGCGTCGACAGCGTCGACGAATG-3’ (SEQ ID NO:3)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)
反应2在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为:①94 度 5min②94 度 30s，61 度 30s，72 度 Imin94 度 30s，53 度 30s，72 度 Imin 16 个循环②72 度 5min上游引物3:5， -CTTCGAGGCGATGAAGTGGGTAACCTTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCGCGA-3，(SEQ ID NO:4)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)
扩增产物进行I %琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小是否与预期结果吻合，确定是否得到正确目的基因。利用上游引物2和上游引物3引入跨膜肽TAT序列和人血清白蛋白信号肽的部分序列和Bstpl04I位点，并利用下游引物I引入EcoR I位点，PCR引入上述序列和酶切位点后，回收目的片段。用相应酶切后，连入用同样酶切后的质粒PPICZ α，构建毕赤酵母表达载体pPICZ a /TAT-0ct4，然后转化大肠杆菌，提取质粒并进行酶切鉴定和DNA序列测定分析。测序结果显示插入pPICZ α载体的序列包括人血清白蛋白信号肽、TAT序列和人0ct4基因序列，具体DNA序列如下:ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCGCGAGGTGTGTTTCGTCGATACGGTAGAAAGAAGCGTCGACAGCGTCGACGAATGGCGGGACACCTGGCTTCGGATTTCGCCTTCTCGCCCCCTCCAGGTGGTGGAGGTGATGGGCCAGGGGGGCCGGAGCCGGGCTGGGTTGATCCTCGGACCTGGCTAAGCTTCCAAGGCCCTCCTGGAGGGCCAGGAATCGGGCCGGGGGTTGGGCCAGGCTCTGAGGTGTGGGGGATTCCCCCATGCCCCCCGCCGTATGAGTTCTGTGGGGGGATGGCGTACTGTGGGCCCCAGGTTGGAGTGGGGCTAGTGCCCCAAGGCGGCTTGGAGACCTCTCAGCCTGAGGGCGAAGCAGGAGTCGGGGTGGAGAGCAACTCCGATGGGGCCTCCCCGGAGCCCTGCACCGTCACCCCTGGTGCCGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTGGAGCAAAACCCGGAGGAGTCCCAGGACATCAAAGCTCTGCAGAAAGAACTCGAGCAATTTGCCAAGCTCCTGAAGCAGAAGAGGATCACCCTGGGATATACACAGGCCGATGTGGGGCTCACCCTGGGGGTTCTATTTGGGAAGGTATTCAGCCAAACGACCATCTGCCGCTTTGAGGCTCTGCAGCTTAGCTTCAAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCCTTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAGCTGACAACAATGAAAATCTTCAGGAGATATGCAAAGCAGAAACCCTCGTGCAGGCCCGAAAGAGAAAGCGAACCAGTATCGAGAACCGAGTGAGAGGCAACCTGGAGAATTTGTTCCTGCAGTGCCCGAAACCCACACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAGGATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCAGAAGGGCAAGCGATCAAGCAGCGACTATGCACAACGAGAGGATTTTGAGGCTGCTGGGTCTCCTTTCTCAGGGGGACCAGTGTCCTTTCCTCTGGCCCCAGGGCCCCATTTTGGTACCCCAGGCTATGGGAGCCCTCACTTCACTGCACTGTACTCCTCGGTCCCTTTCCCTGAGGGGGAAGCCTTTCCCCCTGTCTCCGTCACCACTCTGGGCTCTCCCATGCATTCAAACTGA(SEQ ID NO:5)含有上述序列的表达载体成功转化毕赤酵母后，经酵母表达获得的融合蛋白序列为:YGRKKRRQRRRMAGHLASDFAFSPPPGGGGDGPGGPEPGWVDPRTWLSFQGPPGGPGIGPGVGPGSEVWGIPPCPPPYEFCGGMAYCGPQVGVGLVPQGGLETSQPEGEAGVGVESNSDGASPEPCTVTPGAVKLEKEKLEQNPEESQDIKALQKELEQFAKLLKQKRITLGYTQADVGLTLGVLFGKVFSQTTICRFEALQLSFKNMCKLRPLLQKffVEEADNNENLQEICKAETLVQARKRKRTSIENRVRGNLENLFLQCPKPTLQQISHIAQQLGLEKDVVRVffFCNRRQKGKRSSSDYAQREDFEAAGSPFSGGPVSFPLAPGPHFGTPGYGSPHFTALYSSVPFPEGEAFPPVSVTTLGSPMHSN(SEQID NO:6)取10 μ g 15 μ g pPICZ α /TAT_0ct4重组质粒经Sac I酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10 μ I超纯水溶解后置冰上备用。从毕赤酵母Χ-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，250rpm，30°C震荡培养8小时，以常规方法制备酵母感受态细胞。然后取80 μ I上述感受态菌，与10 μ g 15 μ g线性化的重组表达质粒混合，移入
0.2cm电转化杯内进行电转化。取50 μ I 100 μ I转化后的菌液涂布于含Zeocin(100 μ g/ml)的YPD平板上，30°C培养箱培养2 3天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，提取酵母基因组DNA并进行使用上游引物1:5，-CAGCGTCGACGAATGGCGGGACACCTGG-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物1:5，-CCAGAATTCTCAGTTTGAATGCATGG-3’ (SEQ ID NO:2)进行PCR鉴定，鉴定结果如附图1所示。实施例3:TAT-0ct4的表达及最佳表达条件的确定(I)融合蛋白TAT-0ct4表达最佳诱导时间的确定取上述鉴定结果阳性的克隆接种IOmlBMGY (pH6.0)培养基中，30°C震荡培养24小时，至0D_达到2 .0 6.0时收集细胞。用等体积(IOml) BMMY (pH6.0)重悬细胞沉淀，30°C震荡培养，诱导表达。诱导过程中，每24小时补充一次甲醇至终浓度0.5%，同时补充灭菌超纯水，使发酵液总体积保持不变。在培养的第0、24、48、72、96、120、144、168、192、216小时各时间点各取1.0ml发酵液，离心取上清用于SDS-PAGE蛋白质分析。结果如附图2所示，诱导表达上清，在192小时表达量最大。(2)融合蛋白TAT_0ct4表达最佳pH的确定毕赤酵母对培养基的pH适应范围很广，但是在表达表达外源蛋白的过程中，培养液PH对外源蛋白的表达有很大的影响。因此，在摇床水平进行了表达TAT-0ct4的pH优化，为融合蛋白TAT-0ct4的表达提供必要参数。选取表达量高的融合蛋白TAT-0ct4毕赤酵母工程菌接种于IOmlYPD培养基中，30°C、250r/min震荡培养24 36h。取上述培养的菌液Iml接种于IOOmlBMGY培养基中30°C、250r/min震荡培养24 36h。分别取上述菌液IOml置于50ml离心管中，室温离心(3000r/min) IOmin,弃上清。各管分别加入未加缓冲液的BMMY 9ml，加入Imol.L^1Na2HPO4和0.5mol.Γ1柠檬酸配制成不同pH的BMMY诱导表达(TAT-0ct4 工程菌分别在 pH 为 3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的条件下诱导表达，确定TAT-0ct4表达的最适pH，30°C、225r/min震荡培养，诱导过程中每24h补充甲醇至终浓度为0.5%，同时补充灭菌去离子水，使培养液总体积保持不变。在培养24、48、72、96、120、144、168、192小时等时间点各取Iml培养液，离心取上清进行蛋白质定量分析(SDS-PAGE法)。结果如附图3显示，最佳诱导pH值为7.5。实施例4:TAT-0ct4多肽的理化性质鉴定(I)SDS-PAGE 分析用SDS-PAGE进行蛋白质分子量的测定和粗略定量分析。方法如下:制胶:按如下比例灌制分离胶和浓缩胶。①12 %分离胶的配制:
超纯水3.3ml 30%丙烯酰胺 4.0ml Tris-HCl (pH 值=8.8) 2.5ml10 % 过硫酸按 0.03ml TEMED 0.004ml 10% SDS 0.1ml②浓缩胶的配制:超纯水3.4ml 30 % 丙烯酰胺 0.83ml Tris-HCl (pH 值=6.8)0.630ml10 % 过硫酸按 0.05ml TEMED 0.005ml 10% SDS 0.05ml③分别取24h、48h、72h、96h、120、144、168、192h 培养上清按 4: I 比例加入5 X SDS样品缓冲液，混匀后，煮沸5min。④取出上述样品，冷却至室温后，离心(10000r/min) lmin,取上清每孔加样50 μ I。⑤50V电泳至浓缩胶与分离胶交界处，调整电压到100V，恒压电泳分离。⑥考马斯亮蓝染色、脱色后，观察分析结果。(2)表达产物的Western印迹分析按照常规方法将发酵液上清经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥30 60分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0.2% BSA的TTBS)，室温轻轻振荡2 3小时或4°C封闭过夜。封闭结束后，将NC膜放入杂交袋中按0.1ml抗体溶液/cm2膜加入兔抗人0ct4抗体，室温振荡4小时。膜用TTBS漂洗5次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体至1: 200 1: 1000，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡4小时。加入Iml0.3% (W/V)NiCl或CoCl2及10 μ I 30% H2O2溶液。洗膜后，将膜移入显色液中， 室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图4所示，TAT-0ct4可以与人0ct4抗体特异性结合。


本发明涉及蛋白质制备和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达一种穿膜肽(TAT)与人Oct4的融合蛋白(TAT-Oct4)的方法。