抗-vegf抗体的制作方法[0001]本申请是申请日为2008年10月8日、申请号为200880128968.5、发明名称为“抗-VEGF抗体”的中国发明专利申请的分案申请。[0002]背景[0003]抗体是结合特异性抗原的蛋白质。通常，抗体对于其靶是特异性的，具有介导免疫效应物机制的能力，并且在血清中具有长半衰期。这样的特性使得抗体成为有力的治疗剂。在治疗上使用单克隆抗体，用于治疗各种病症，包括癌症、炎症和心血管疾病。目前在市场上存在十种以上的治疗性抗体产品，并且有上百种在研发中。[0004]对新的抗体存在持续的需求。[0005]发明概述[0006]提供了一种抗体。在某些情况下，该抗体包含:a)包括与图1中所示的选定抗体的重链⑶R区基本上相同的⑶R区的重链可变结构域和b)包括与选定抗体的轻链⑶R区基本上相同的CDR区的轻链 可变结构域，其中该抗体结合选定的靶。在某些实施方案中，抗体的CDR区相对于选定抗体的CDR区，总地可以含有，例如，一个、两个、三个、四个、五个或至多10个氨基酸差异(例如，氨基酸置换、缺失或插入)。在某些情况下，本发明抗体的⑶R区可以具有由源自几个相关抗体分析的共有序列限定的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体的CDR区可以与选定抗体的CDR区相同。[0007]在特定的实施方案中，所述抗体可以包含:可变结构域，其包括:a)重链可变结构域，其包括:1.氨基酸序列与图1选定抗体的重链⑶Rl区相同的⑶Rl区；i1.氨基酸序列与选定抗体的重链⑶R2区相同的⑶R2区；和ii1.氨基酸序列与选定抗体的重链⑶R3区相同的CDR3区；和b)轻链可变区，其包括:1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDRl区相同的⑶Rl区；i1.氨基酸序列与选定抗体的轻链⑶R2区相同的⑶R2区；和ii1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；其中抗体特异性地结合选定的靶。[0008]在某些实施方案中，抗体包含:a)可变结构域，其包括:1.氨基酸序列与图1选定抗体的重链⑶Rl区相同的⑶Rl区氨基酸序列与选定抗体的重链⑶R2区相同的⑶R2区，和ii1.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR3区相同的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包括:1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDRl区域相同的CDRl区；i1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和ii1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；或b)部分a)的可变结构域的变体，该变体除了在CDR区中有一定数量(例如，
1、2、3、4、5、6、7或8个)的氨基酸置换，其他与部分a)的可变区相同，其中该抗体结合选定的靶，并且在某些实施方案中，结合选定靶的活性。
[0009]在某些实施方案中，抗体可以包含选自表1的⑶R共有组的⑶R。在某些实施方案中，抗体可以包含:a)重链可变结构域，其包括:1.包括选自表1的CDR共有组的CDRl氨基酸序列的⑶Rl区；i1.包括选定⑶R共有序列的⑶R2氣基酸序列的⑶R2区；和ii1.包括选定CDR共有序列的CDR3氨基酸序列的CDR3区；和b)轻链可变结构域，其包括:1.包括选定⑶R共有序列的⑶Rl氨基酸序列的⑶Rl区；i1.包括选定⑶R共有序列的⑶R2氨基酸序列的⑶R2区；和ii1.包括选定⑶R共有序列的⑶R3氨基酸序列的⑶R3区；其中所述抗体特异性地结合选定的靶，在某些实施方案中，结合选定靶的活性。
[0010]还提供了包括本发明抗体和药物学上可接受载体的药物组合物。
[0011]还提供了一种方法。在某些实施方案中，该方法可以包括在适于抗体与靶结合以产生复合物的条件下，使本发明抗体与抗体的靶接触。
[0012]还提供了阻断配体结合其受体的方法。在特定的实施方案中，该方法可以包括:将本发明抗体给予受治疗者，其中所述抗体结合所述患者体内的受体或配体并且阻断所述配体及其受体的结合。
[0013]选定的靶可以是VEGF。
[0014]附图简述
[0015]图1显示了选定的VEGF-阻断抗体的氨基酸序列。图1的第I页显示了重链的氨基酸序列。图1的第2页显示了相应轻链的氨基酸序列。每个抗体的CDR的氨基酸序列是框起来的。图1中显示的氨基酸序列是特异性结合VEGF并中和VEGF活性的抗体。从上至下，图1 (第 1/2 页)SEQ ID NO: 1-38 和图1 (第 2/2 页)SEQ ID NO:39-76。
[0016]定义 [0017]在进一步描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的特定实施方案，因为这些当然可以改变。还应当理解在此所用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而不是限制性的，因为本发明的范围将只由所附权利要求来限制。
[0018]除非另外限定，在此所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意思。尽管与在此所述那些相似或相等的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但现在将描述优选的方法和材料。在此提及的所有出版物引入文中作为参考，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
[0019]必须注意到如在此和所附权利要求中所用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非文中另外清楚地指出。因此，例如，对“抗体”的提及包括多个这样的抗体，对“构架区”的提及包括一个或多个构架区及其本领域技术人员已知的等价物，诸如此类。
[0020]在此所讨论的出版物仅仅是为了在本申请提交日之前的公开内容而提供的。在此没有构成承认由于现有技术的发明而本发明有权先于这些出版物。此外，所提供出版物的日期可以不同于实际出版日期，这可能需要单独证实。
[0021 ] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换使用。这些术语是本领域技术人员充分理解的，并且指的是由一个或多个特异性结合抗原的多肽组成的蛋白质。一种形式的抗体组成抗体的基础结构单位。这种形式是四聚物，由两个相同对的抗体链组成，每对具有一个轻链和一个重链。在每对中，轻链和重链可变区一起负责与抗原的结合，并且恒定区负责抗体效应物功能。
[0022]所识别的免疫球蛋白多肽包括K和λ轻链以及a、y (IgG1UgG2UgG3UgG4Xδ、ε和μ重链，或其他物种中的等价物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包括NH2-末端的约110个氨基酸的可变区和COOH-末端的K和λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)，相似地包括可变区(约116个氨基酸)和上述之一的重链可变区,例如Y (约330个氨基酸)。
[0023]术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白，保持特异性结合抗原的抗体片段，包括，但不限于，Fab、Fv、scFv和Fd片段,嵌合抗体,人源化抗体,单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。抗体可以是可检测标记的，例如，使用放射性同位素、产生可检测产物的酶、荧光蛋白等。可以进一步将抗体缀合其他部分，如特异性结合对的成员，例如，生物素(生物素-抗生物素蛋白特异性结合对的成员)等。还可以将抗体结合固体支持物，支持物包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等。术语还包括Fab’、Fv、F(ab’)2和或保持特异性结合抗原的其他抗体片段，以及单克隆抗体。抗体可以是单价的或双价的。
[0024]抗体可以以各种其他形式存在，包括，例如，Fv，Fab和(Fab’)2，以及双功能(即，双特异性)杂交抗体(例如，Lanzavecchia等,Eur.J.1mmunol.17,105 (1987))和单链形式(例如，Huston 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.,85, 5879-5883, (1988)和 Bird 等，Science,242,423-426 (1988)，在此将其引入作为参考)。(参见，总地，Hood等，“Immunology”,Benjamin, N.Y.,第 2 版，(1984),和 Hunkapiller 和 Hood, Nature, 323,15-16 (1986)。
[0025]免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个超变量区隔断的“构架”区(FR)组成，这三个超变量区也称为“互补决定区”或“⑶R”。之前已经限定了构架区和⑶R的范围(参见，“Sequences of Proteins of Immunological Interest，，，E.Kabat 等，U.S.Department ofHealth and Human Services, (1991))。在此讨论了所有抗体氨基酸序列的编号遵照Kabat系统进行。不同轻链或重链的构架区的序列在物种内相对保守。抗体的构架区，是组成的轻链和重链的组合构架区，用于定位和比对⑶R。⑶R主要负责结合抗原的表位。
[0026]嵌合抗体是其轻链和重链基因通常是通过遗传工程从属于不同物种的抗体可变区和恒定区构建的抗体。例如，可以将来自非人单克隆抗体的基因的可变片段结合人的恒定片段，如Yl和Y3。治疗性嵌合抗体的一个实例是由来自兔抗体的可变区或抗原结合结构域和来自人抗体的恒定区或效应物结构域组成的杂交蛋白(例如，由A.T.C.C.保藏号CRL9688的细胞制得的抗-Tac嵌合抗体)，尽管可以使用其他哺乳动物物种。 [0027]如在此所用的，术语“人源化抗体”或“人源化免疫球蛋白”指的是含有一个或多个氨基酸已经由来自人抗体的相应位置的氨基酸置换的非人(例如，小鼠或大鼠)抗体。在一些情况中，与相同抗体的非人源化形式相比，人源化抗体在人宿主中产生降低的免疫响应。
[0028]将理解通过本发明方法设计和产生的人源化抗体具有对抗原结合或其他抗体功能基本上没有影响的氨基酸置换。
[0029]“相似的氨基酸”如下定义:gly，ala ；val, ile, leu ；asp, glu ；asn, gin ；ser, thr ；lys, arg ;和phe, tyr。换句话说，gly和ala是相似的氨基酸；val, ile和Ieu是相似的氨基酸；asp和glu是相似的氨基酸；asn和gin是相似的氨基酸；ser和thr是相似的氨基酸；lys和arg是相似的氨基酸；phe和tyr是相似的氨基酸。用相似氨基酸的氨基酸取代在此称为“保守性氨基酸置换”。不存在上述相同组中的氨基酸是“不相似”的氨基酸。
[0030]术语“特异性结合”指的是抗体优先结合不同分析物的均质混合物中存在的特定分析物的能力。在某些实施方案中，特异性结合的相互作用将区分出样品中所需的和不需要的分析物，在一些实施方案中，相互作用超过约10至100倍，或更高(例如，超过约1000或 10，000 倍)。
[0031]在某些实施方案中，当抗体及其靶在捕获剂/分析物复合物中特异性结合时，它们之间的亲和性特征在于低于10_6m的Kd (解离常数)，低于10_7M，低于10_8M，低于10_9M，低于IQ-9M,低于IQ-11M,或低于约IQ-12M或更低。[0032]重链或轻链抗体链的“可变区”是链的N-末端成熟区。基于序列比对和结构知识来指定所有结构域、⑶R和残基编号。按照Kabat, Chothia (Chothia, Structuraldeterminants in the sequences of immunoglobulin variable domain.J Mol Bioll998 ；278:457-79)等所述的来进行构架区和⑶R残基的鉴定和编码。
[0033]VH是抗体重链的可变结构域。VL是抗体轻链的可变结构域，其可能是K (K)或入同种型。K-1抗体具有K-1同种型，而Κ-2抗体具有K-2同种型，并且V λ是可变λ轻链。
[0034]如在此所用的，术语“测定”、“测量”和“测试”和“试验”可以互换使用，并包括定
量和定性测定。
[0035]术语“多肽”和“蛋白质”，在此可互换使用，指的是任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码的和非编码的氨基酸，化学或生化上修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽主链的多肽。术语包括融合蛋白，包括，但不限于，具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列的融合体，具有或不具有N-末端甲硫氨酸残基；免疫学标记的蛋白质；具有可检测融合伴侣的融合蛋白，例如，包括作 为融合伴侣的荧光蛋白、β_半乳糖苷酶、荧光素酶等；等等。多肽可以是任何大小的，并且术语“肽”指的是8-50个残基(例如，8-20个残基)长的多妝。
[0036]如在此所用的，术语“分离的”，在分离的抗体内容中使用时，指的是至少60%，至少75%，至少90%，至少95%，至少98%，甚至至少99%的本发明抗体从纯化之前与其相连的其他成分中游离出来。
[0037]在此所用的术语“治疗”、“治疗中”等指的是哺乳动物(例如，特别是人或小鼠)中任何疾病或病症的任何治疗，并包括:a)防止疾病、病症，或疾病或病症的症状在易患病但尚未诊断出患病的患者中的发生；b)抑制疾病、病症，或疾病或病症的症状，例如，阻止其在患者中的发展和/或延迟其发作或呈现；和/或c)缓解疾病、病症，或疾病或病症的症状，例如，引起病症或疾病和/或其症状的消退。
[0038]术语“受治疗者”、“宿主”、“患者”和“个体”在此可互换使用，指的是需要诊断或治疗的任何哺乳动物患者，特别是人。其他患者可以包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。
[0039]“相应的氨基酸”是两个或多个氨基酸序列比对时，相同位置(即，它们彼此相对排列的位置)的氨基酸残基。将抗体序列比对和编码的方法更详细地列于上文的Kabat中以及其他的文献中。如本领域所知的(参见，例如，Kabat 1991, Sequences of Proteins ofImmunological Interest, DHHS, Washington, DC),有时候，为了完成比对，可以形成一个、两个或三个缺口和/或至多一个、两个、三个或四个残基，或至多约15个残基的插入(特别是在L3和H3CDR中)。
[0040]“天然”抗体是其中抗体的重链和轻链免疫球蛋白是通过多细胞生物体的免疫系统自然选择的抗体，与通过例如噬菌体展示制得的非天然配对抗体或人源化抗体相对。因此，特定的抗体不含有任何病毒(例如，噬菌体M13)-衍生的序列。脾脏、淋巴结和骨髓是产生天然抗体的组织的实例。
[0041]“亲本”抗体是氨基酸置换目标的抗体。在某些实施方案中，氨基酸可以由“供体”抗体“捐赠”给亲本抗体，以产生改变了的抗体。[0042]“相关抗体”是具有相似序列并由具有通用B细胞祖先的细胞产生的抗体。这样的B细胞祖先含有具有重排轻链VJC区和重排重链VDJC区的基因组，并产生尚未经受亲和性成熟的抗体。脾脏组织中存在的“天然”或“原始”B细胞是示例性的B细胞通用祖先。相关抗体结合抗原的相同表位，并且序列通常是非常相似的，特别是在其L3和H3CDR中。相关抗体的H3和L3CDR具有相同的长度和接近相同的序列(例如，有0-4个残基不同)。相关抗体通过通用抗体祖先来互相关联，通用抗体祖先是天然B细胞祖先中产生的抗体。术语“相关抗体”不是用于描述一组不具有由B-细胞产生的通用抗体祖先的抗体。在某些情况下，相关抗体:1.结合相同的抗原；i1.各自包括相对彼此具有至少90%整体氨基酸序列同一性的重链可变结构域；ii1.各自包括相对彼此具有至少90%整体氨基酸序列同一性的轻链可变结构域具有相对彼此长度相同和序列相同(除了 0、1或2个氨基酸置换)的H3⑶R ;和V.具有相对彼此长度相同和序列相同(除了 0、1或2个氨基酸置换)的L3⑶R。
[0043]“阻断抗体”、“中和抗体”或“中和……的抗体”或其任何语法等价物指的是其与靶的结合导致将与靶的结合或靶的生物活性抑制例如至少约20%、30%、40%、50%、80%、95%或99%的抗体。通过测量靶生物活性的一个或多个指标来测定这种靶生物活性的抑制，这些指标如受到靶影响的信号转导途径的激活、结合或细胞改变。可以通过本领域已知的几个标准体外或体内试验中的一个或多个来测定在此所述的靶的生物活性。
[0044]如在此所用的术语“VEGF”或其非缩写形式“血管内皮生长因子”指的是由VEGF基因编码的蛋白质产物。VEGF涉及血管发生(胚胎循环系统的重新形成)和血管生成(血管从预先存在的脉管系统开始的生长)。VEGF家族的所有成员通过结合细胞表面上的酪氨酸激酶受体(VEGFR)来刺激细胞响应，使它们二聚化并通过转磷酸作用得到激活。VEGF受体具有包含7个免疫球蛋白样结构域的胞外部分、单个跨膜横跨区和包含分裂酪氨酸-激酶结构域的胞内部分。VEGF-A 结合 VEGFR-1 (Flt-1)和 VEGFR-2 (KDR/Flk-1)。VEGFR-2 看来似乎介导几乎全部已知的对VEGF的细胞响应。VEGF，其生物活性及其受体都得到了充分的研究并在 Matsumoto 等(VEGF receptor signal transduction (VEGF 受体信号转导)，SciSTKE.2001: RE21)和 Marti 等(Angiogenesis in ischemic disease(缺血性疾病中的血管生成)Thromb Haemost.1999增补1:44-52)的论文中有描述。术语VEGF用于包括重组的VEGF分子，其可以通过标准重组表达方法来制备或商业购买(R&D Systems, Catalog N0.210-TA,Minneapolis, Minn.)，以及含有VEGF分子的融合蛋白。在此可以使用的示例性VEGF的氨基酸序列可以在NCBI的Genbank数据库中找到，并且人VEGF的全部描述及其在各种疾病和病症中的作用可以在Man数据库的NCBI’ s Online Mendelian Inheritance中找到。
[0045]发明详述
[0046]提供了一种抗体。在某些情况下，该抗体包含:a)包括与图1中所示的选定抗体的重链⑶R区基本上相同的⑶R区的重量可变结构域和b)包括与选定抗体的轻链⑶R区基本上相同的CDR区的轻链可变结构域，其中该抗体结合选定的靶。在某些实施方案中，抗体的⑶R区相对于选定抗体的⑶R区，总地可以含有，例如，一个、两个、三个、四个、五个至至多10个氨基酸差异(例如，氨基酸置换、缺失或插入)。在一些实施方案中，抗体的CDR区可以与选定抗体的CDR区相同。如显而易见的，这样的抗体进一步含有决定CDR的位置的构架序列。 [0047]在特定的实施方案中，本发明抗体可以具有:a)具有与图1中所示的选定抗体的重链可变结构域为至少80%同一性(例如，至少90%，至少95%或至少98%或99%同一性)的氨基酸序列的重链可变结构域和b)具有与选定抗体的轻链可变结构域为至少80%同一性(例如,至少90%，至少95%或至少98%或99%同一性)的氨基酸序列的轻链可变结构域。
[0048]在特定的实施方案中，抗体可以包含:a)重链可变结构域，其包括:1.氨基酸序列与图1的选定抗体的重链CDRl区相同的CDRl区；i1.氨基酸序列与选定抗体的重链CDR2区相同的⑶R2区；和ii1.氨基酸序列与选定抗体的重链⑶R3区相同的⑶R3区；和b)轻链可变结构域，其包括:1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDRl区相同的CDRl区；i1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR2区相同的CDR2区；和ii1.氨基酸序列与选定抗体的轻链CDR3区相同的CDR3区；其中该抗体特异性地结合选定的靶。
[0049]用单个抗原使兔免疫产生多重抗体，这些抗体可以通过它们序列的关联性来分组。每组内的抗体彼此相关，因为它们是由具有共同天然B细胞祖先的细胞产生的。由祖先B细胞产生的抗体尚未经受亲和性成熟，而相关抗体已经经受亲和性成熟和B-细胞发育的最后阶段，并从通用B-细胞祖先抗体的“发展”而来，因为它们含有由亲和性成熟过程中发生的体细胞超突变、基因转变和其他细胞突变事件引起的氨基酸置换。
[0050]可以将相关抗体的氨基酸序列进行比较(例如，通过比对那些序列)，并且根据它们彼此的相似性将抗体归类，以鉴定相关组的抗体。相关抗体组的抗体通常含有接近相同的序列，具有长度相同的CDR区，并在构架和/或CDR区中具有氨基酸序列的差异。这些差异表示可以在任一相关抗体中被置换的氨基酸。在某些情况下，一个位置上的氨基酸可以是不相似的氨基酸，例如，在该情况下，在该位置的氨基酸可以由任何其他氨基酸置换。在其他情况下，一个位置上的氨基酸可以是相似的氨基酸，在该情况下，该位置上的氨基酸可以由相似的氨基酸置换，其中相似氨基酸如上所定义。在某些情况下，如果氨基酸不同，可以将来自一个相关抗 体的氨基酸替换成另一个的。
[0051]因为最初通过免疫过的动物的免疫系统产生并有效测试了特定共有组的每个CDR，用一个氨基酸替换成另一个共有氨基酸应当是抗体充分耐受的。将图1的抗体进行比对，鉴定相关的抗体组，并鉴定出共有序列。在某些情况下，抗体可以包括CDR共有组的⑶R，其中⑶R共有组源自相关抗体的序列比对。图1抗体的共有序列显示于表1中。表1表示本发明抗体中的可置换位置，其中例如，置换可以是任何其他氨基酸、相似氨基酸(即，保守性氨基酸置换)或来自一个抗体的置换另一个的。这样的方法在美国专利申请10/984, 473 (作为US-2006-0099204公开)中有进一步的描述，为了那些方法的公开内容，将其引入作为参考。
[0052]在某些实施方案中，所述抗体可以包含选自表1的⑶R共有组的⑶R。在特定的实施方案中，所述抗体可以包含:a)重链可变结构域，其包括:1.包括选自表1的CDR共有组的⑶Rl氣基酸序列的⑶Rl区；i1.包括选定⑶R共有序列的⑶R2氣基酸序列的⑶R2区；和ii1.包括选定⑶R共有序列的⑶R3氨基酸序列的⑶R3区；和b)轻链可变结构域，其包括:1.包括选定⑶R共有序列的⑶Rl氨基酸序列的⑶Rl区；i1.包括选定⑶R共有序列的⑶R2氨基酸序列的⑶R2区；和ii1.包括选定⑶R共有序列的⑶R3氨基酸序列的⑶R3区；其中所述抗体特异性地结合选定的靶。
[0053]例如，这样的抗体可以包含:a)重链可变结构域，其具有:1.通式NNA/DVMC(SEQ IDNO:77)的 CDRl，通式 CMTTDVVTE/AYANWAKS (SEQ ID NO:78)的 CDR2 和通式 DSVGSPLMSFDL(SEQ ID NO:79)的 CDR3，和；b)轻链可变结构域,其具有：通式 QASQN/SL/VYN/GNNELS (SEQ ID NO: 80 )的 CDRl，通式 W/RASTLAS (SEQ ID NO: 81)的 CDR2 和通式 A/S/GGYKSYS/YND/GGN/ SG (SEQ ID NO:82)的 CDR3，其中抗体阻断 VEGF。